《紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较》由会员分享，可在线阅读，更多相关《紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150800 纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分 析的一种方法； 分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱 的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行 分析。组成部件：紫外可见分光光度法：辐射源。必须具有稳定的、有足够输出功率 的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围 350 2500纳米） ，氘灯或氢灯（180460纳米），或可调谐染料激光光源等。单色器。它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜
2、或光栅）组 成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光 分解为单色光和分出所需的单色光束。试样容器，又称吸收池。供盛放 试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到 可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为0.510厘米。检测器，又称光电转换器。常用的有光电管或光电倍增管。显示装置。这部分装置发展较快。较高级的光度计 ，常备有微处理机 、荧光屏显示和记录仪等 ，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。单光束双光束分1.苣光光度法激发光源、单色器、样品池、锦i器和记录显示部分。 源 能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯
3、。 2. 单色器，两个单色器。 3. 样品池 通常用石英制成。4. 检测器：光电倍增管。检测器伞 J八狭缝发射单色器I狭缝狭缝狭缝常见类型:1扫描纫卜可见分光光度 吸光度或透光度,发般不能作全波段光具有很高的稳定性。2双光束自动记录，快速全波段扫描。可消除 光溉源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。 仪器复杂，价格较高 ）快束交替通过同2参比池。 =12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。 分子荧光光度法：1.光电荧光计 用滤光片作单色器（激发滤光片单光束。适于在给定波长处测,要求光源和检测器高。3.双波长。将不同波长的两束单色光（人、人 一吸收池而后到达检测器。产生交
4、流信号。无需和荧光光片），溴钨灯或高压汞灯作光源，光电管为检测器。 2. 荧光 分光光度计 用氙灯作光源、光栅作单色器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激发光谱和荧光光谱。原理： 紫卜可见分光光度法：紫卜 - 可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸 收谱带组成。最大吸收波长（入max）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中卜层电子或价电子的结构（ 或成键、非键和 反键电子 ）有关。朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。这 个定律表示：当一束具有 I0 强度的单色辐射照射到吸收层厚度为 b， 浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层 的厚度。其数学表达式为：式中的A叫做吸
5、光度；10为入射辐射强 度；I为透过吸收层的辐射强度；（1/10）称紫藤为透射率T； 是一个常数，叫做摩尔吸光系数，值愈大，分光光度法测定的灵敏 度愈高。分子荧光光度法：分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一 电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过 以下几种途径释放能量返回基态。 1. 振动驰豫 。这一过程只能发生 在同一电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较 高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射 跃
6、迁。 2. 内转换 。即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较 高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。 3. 荧 光 较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动 能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 S,称作荧光寿命）， 以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为 荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态。 4. 系间窜跃 有些物 质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最 低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这 一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。对于大多数物质，系 间窜跃是禁阻的。如果分子中
7、有重原子（如I、Br等）存在，由于自 旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容 易了。荧光的检测： 光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不 同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出 的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不 同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过 溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向 检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。 激发与荧光光谱的形成： 任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱 （excitation spectrum）和荧光发射光谱fluorescence
8、 emission spectrum）。荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单色 器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强 度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧 光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最 大发射波长。灵敏度：紫外可见分光光度法：灵敏度很高，达 0.00001-0.0000001mol/L； 分子荧光光度法：由于分子荧光是从入射光的直角方向入射，因而灵 敏度要比紫外可见高2-4个数量级，它的测定下限 在0.1-0.001ug/mL。选择性：紫外可见分光光度法：一个物质若含有生色基团，它就会产生紫外和 可
9、见吸收，反过来根据紫外 -可见吸收光谱便可判断某些官能团的存 在，即进行官能团的鉴别，紫外-可见吸收光谱的获得是建立在测定出 物质对不同波长光（单色光）吸收的基础上的。选择性较高。分子荧光光度法：一个物质只要能产生荧光，则可以根据荧光光谱判 别物质的种类（前提是量子产率达到要求），因而选择性较高 ，但由 于不是所有物质都有荧光光谱，应用有一定限制。影响因素：紫外可见分光光度法：1.共轭效应，共轭效应越强，能量差越小， 最大吸收波长想长波方向，吸收强度也增大。 2.立体化学校应，包括 空间位阻和跨环效应，均有影响。 3.溶剂的影响，在溶液中物质是溶 剂化的，影响了溶质分子的自由转动，引起光谱结构
10、精细结构的消失。4.体系PH的影响，无论是酸性碱性,体系的PH对紫外可见光谱的影 响 是普遍的现象。分子荧光光度法：1. 跃迁类型，物质必须在紫外可见区有强吸收和高 荧光效率才能产生荧光。具有 *跃迁的分子才有强吸收。兀 跃迁的s大。2.共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或 杂环，具有共轭的兀兀*跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大， 且最大激发和发射波长都向长波长方向移动，如苯、萘、蒽三种物质。3.刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的刚性和共平面 性越大，荧光效率越大。有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金 属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增 强
11、荧光。如 8-羟基喹啉是弱荧光物质，与 Mg2+、Al3+ 等金属离子形成 的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。4. 取代 基团 。荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很 大影响。给电子取代基如 NH 、OH、OCH 、CN、NHR、NR2 3 2等，能增加分子的n电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH、一NO、 C=0、一F、一Cl等吸电子取代基，可减弱分子n电子共轭性，使 荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如一R。5.温度。温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。当温度升高时， 介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分
12、子无 辐射跃迁增加，荧光效率降低。故降低温度有利于提高荧光效率及荧 光强度。 6. 溶剂：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位 置和荧光强度可能会有一定的差别，尤其是那些分子中含有极性取代 基的荧光物质，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。6溶液的酸度（pH 值）对荧光物质的影响可以分两个方面： 1若荧光物质本身是弱酸 或弱碱时，溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变 化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺。2.对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物，溶液pH值的改变会 影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。例如Ga3+离子与邻-二 羟基偶氮苯，在pH3
13、4的溶液中形成1:1配合物，能产生荧光。而在 pH67的溶液中，则形成12的配合物，不产生荧光。误差来源：紫外可见分光光度法：偏离比尔定律、仪器本身的测量误差。偏离 比尔定律的原因：1，比尔定律本身的局限，仅在单色光下成立。 2， 非单色入射光引起的偏离。比尔定律仅在入射光为单色光时才成立 事实上单色器很难将光源的连续光色散成其正的单色光，而是具有较窄波长范围的复合光，光通量为0.015nm。还有溶液的化学偏离。 由于被测物质在溶液中发生缔合、离解、互变异构，生成逐级配合物 等化学原因造成对比尔定律的偏离。分子荧光光度法：荧光熄灭：由于荧光物质分子间或与其它物质相互 作用，引起荧光强度显著下降
14、的现象叫做荧光熄灭（quenching）或 猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂，如卤素离子、重金属离 子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。 注意事项：紫外可见分光光度法：显色温度，显色时间，溶剂的影响，合适的PH。 分子荧光光度法：激发波长的选择，激发时间的选择，常闭物质的选 择等。分析方法：紫外可见分光光度法：定性分析：根据吸收光谱的形状，吸收峰的数目,用经验规则计算A 与测定的A 比较；比较未知物与标准 物质在相同化学环境与测量条件下的紫外卜-可见吸收光谱，若吸收光 谱的形状、吸收峰的数目、 （人）、人 完全相同，就可以确定 maxmax未知物与标准物质具有相同的生色团与
15、助色团，但并不能断定两者为同一化合物。结构分析：根据官能团特征波普来判断。定量分析：比 尔定律，可利用工作曲线求解，多组分同时测定时，可用吸光度加和 性求解。 分子荧光光度法：定性分析：荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧 光光谱，因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。定量分析：标准曲线法 和直接比较法。应用：紫外可见分光光度法：无机阴、阳离子的测定利用高灵敏、高选择性的有机显色剂，与被测无机离子发生配合或氧 化还原反应，可测定周期表中绝大多数元素。两组分的同时测定 例：临床中麻醉剂：普鲁卡因丁卡因注射液 它含有两种成分：盐酸普鲁卡因和盐酸丁卡因这两种化合物结构相似，最大吸收波长分别为291和312n
16、m。但盐酸 丁卡因的毒性比前者大 10 倍，因此配制时应严格限制其含量，可采 用双波长，利用吸光度具有加和性来测定和求解，以减少二种化合物 吸收峰重叠而产生的测量误差。有机化合物的定量分析 直接法。若有机化合物本身在结构上含有双键或芳环，即含有共轭电 子，则可直接测定其含量。如微量氨基酸的测定。氨基酸的吸收波长 在280nm左右，且8较小,低含量的氨基酸很难用直接法准确测定。 可用茚三酮与各种氨基酸反应，生成无色还原型茚三酮，过量的茚三 酮又与还原型茚三酮和氨缩合生成紫蓝色产物，称为 Ruhemann 紫， l =570nm，利用此反应可测微量的氨基酸。 分子荧光光度法：有机物的荧光分析：由于荧光分析的高灵敏度、高 选择性，使它在医学检验、卫生检
