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1、大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase,简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、 Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内 多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(02-)是人体 氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超 氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴 离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景， 并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。SOD的活力测定方法很多，常见的
2、有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化 学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有 色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的 有黄嘌吟氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光 化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。 在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三 酚自氧化方法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出02-，生成带色 的中间产物，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时 间维持在4min的范围内，中间物在420n
3、m波长处有强烈光吸收。当有SOD存在 时，由于它能催化02-与H+结合生成02和H202，从而阻止了中间产物的积累，因 此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。酶活力单位定义：在25r恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚 自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。试剂和器材大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液(PH7.8, 0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液(3； 5v/v)、 邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管8个、紫 外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移
4、液管各5根。方法1. SOD提取称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L 的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀， 得上清液（留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录）。2. 除杂蛋白提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀， 得粗酶液。（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3. SOD酶的沉淀分离剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得 到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。60
5、00rpm离 心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。4. 粗酶液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测， 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸 光值。试剂/ (mL)空白管对照管OD1提取液OD2粗酶液OD2酶液OD2PH8.3缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.25.溶液中可溶性蛋白含量测定分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释， 260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。提取液稀释
6、：50 X 粗酶液稀释：20 X 酶液稀释：10 X实验结果提取液粗酶液酶液总体积（ml）提取液粗酶液酶液260nm吸光度值280nm吸光度值公式蛋白质浓度（呢/也二俱。一直邕。）X稀释倍数蛋白质浓度（mg/ml）对照管（叫）提取液（叫）粗酶液（叫）酶液（OD2）420nm吸光值数据处理1. 酶活力单位提取液酶活力单位：=2 （OD1-OD2）X5/0.1粗酶液活力单位：=2 （OD1-OD2）X5/0.1酶液活力单位：=2 （OD1-OD2）X5/0.12. 总活力提取液总活力U=活力单位X总体积粗酶液总活力二活力单位X总体积酶液总活力二活力单位X总体积3. 比活力提取液酶液比活力U/mg二活力单位/蛋白质浓度粗酶液比活力U/mg二活力单位/蛋白质浓度酶液比活力U/mg二活力单位/蛋白质浓度4. 纯化倍数粗酶液纯化倍数二粗酶液比活力/提取液比活力酶液纯化倍数二酶液比活力/提取液比活力5. 回收率粗酶液回收率二粗酶液总活力/提取液总活力酶液回收率二酶液总活力/提取液总活力实验结果误差分析1. 研磨和离心大概还不够充分。2. 由于测量仪器的精密度引起的误差。3. 在操作的过程中，加入邻苯三酚后未混合均匀，可能致使化学反应进行得不 很充分，这可能是造成实验数据与预期不符的一个原因；4. 在实验过程中，所需化学试剂加入的量不是很准确，这可能是实验数据出现 问题的另一个原因；
