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1、高效液相色谱化学发光法检测牛奶中磺胺类药物残留 摘要以4种磺胺类药物ulfonamides，As，即磺胺脒ulfaguanidine，GD、磺胺嘧啶sulfadiazine，DZ、磺胺噻唑sulfathiazole，Z和磺胺二甲嘧啶ulfamethazine，MZ为分析物，基于其在碱性介质中对Ag配合物鲁米诺Luminol与Ni配合物鲁米诺两化学发光体系发光强度均具有抑制作用的性质，建立了高效液相色谱化学发光法检测牛奶中4种磺胺类药物的方法。将化学发光体系作为高效液相色谱的新型检测器，并对两种化学发光体系的检测器性能进展了比较。4种磺胺药物经高效液相色谱别离后，分别与AgLuminol及NiL
2、uminol化学发光体系作用。色谱条件为：反相C18别离柱250mm46mm，5m；01%甲酸甲醇为流动相V/V；梯度洗脱；流速1mL/min。化学发光条件：Ag、NiLuminol两体系中，Ag配合物浓度1410ymbolm4mol/L含012mol/LNaO；Ni配合物浓度1510ymbolm5mol/L含012mol/LNaO；Luminol濃度均为1210ymbolm7mol/L；试剂流速均为10mL/min。在最正确的别离检测条件下，AgLuminol体系检测4种磺胺类药物的检出限分别为015、096、110和150g/mL，加标回收率为810%1015%；NiLuminol体系检测
3、GD、DZ、Z3种磺胺类药物的检出限分别为15、172和168g/mL，加标回收率为839%1108%。相比之下，AgLuminol体系作为高效液相色谱检测器更佳。应用本方法对牛奶中4种磺胺类药物残留量进展检测，结果令人满意。关键词高效液相色谱；化学发光；Ag配合物；Ni配合物；磺胺类药物1引言磺胺类药物ulfonamides，As为人工合成的一类抗菌药物，在兽医临床上广泛用于预防和治疗动物细菌感染性疾病，常用磺胺药物有磺胺脒ulfaguanidine，GD、磺胺嘧啶ulfadiazine，DZ、磺胺噻唑ulfathiazole，Z、磺胺二甲嘧啶ulfamethazine，MZ等。动物饲养过程
4、中假设长期使用抗生素类药物，会使动物体内致病细菌产生耐药，给动物疾病检疫与防治带来不利影响，且会使药物残留在动物体内。磺胺类药物残留期长，在畜禽等动物源性食品中的残留，严重危害食品平安与公众安康。文献报道了许多用于检测动物源性食品中磺胺类药物多组分残留的方法，其中以高效液相色谱法ighperformanceliquidchromatography，PLC应用最普遍【1】。反相PLC连接紫外UV2、二极管阵列DAD3、荧光FL4检测器广泛用于食品、环境中As残留的例行分析，PLCM/M以其高灵敏度及选择性用于检测或确证分析中5，6。UV、DAD检测器用于磺胺类及其它抗生素残留检测时灵敏度受限；F
5、L检测器灵敏度高，但As需柱前衍生，适宜的衍生试剂不易挑选；M或M/M检测器最有优势，但仪器及运行本钱的压力，使其不易普及。近年来，化学发光分析法Chemiluminescence，CL以其灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、分析速度快等优点，广泛用于环境、生物、生化样品分析中79。鲁米诺Luminol体系是最经典的化学发光体系1012，其发光机理为：鲁米诺在碱性条件下被氧化剂氧化，氧化产物吸收氧化复原反响放出的热量后被激发，激发态回到基态辐射发光。本课题组在前期研究中发现，过渡金属超常氧化态与适当多齿配体络合形成的配合物，在一定条件下能稳定存在并具有较强的氧化性能，如Ag和Ni与过碘酸形成的
6、配合物AgIO625ymbolm，NiIO62O2ymbolm6在碱性条件下是良好的氧化剂1316。将Ag、Ni配合物与鲁米诺组成化学发光体系，通过待测组分对Ag、NiLuminol发光体系的增敏或抑制作用，已成功用于2受体冲动剂、皮质醇等多种药物或生物分子的检测，且具有极高的灵敏度17，18。化学发光灵敏度高，但方法的选择性差。假设将PLC的高效别离才能与CL的高灵敏性结合，首先采用PLC将混合物中的各组分得到有效别离，再利用化学发光检测系统对各组分进展灵敏检测，是一种兼顾高灵敏度与高分辨力的物质别离与检测新方法。本实验以动物源性食品中最易残留的4种磺胺类药物，即磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑和
7、磺胺二甲嘧啶为分析物，基于其对AgLuminol与NiLuminol两化学发光体系发光强度均具有抑制作用的性质，建立了PLCCL检测体系同时别离分析牛奶中4种磺胺类药物的方法，并对两种检测器的性能进展了比较，为PLC法在抗生素残留检测中新检测器的开发提供了思路。同时，比照AgLuminol与NiLuminol两体系在检测灵敏度及检测稳定性等方面的不同，以期更好地与高效液相色谱联用。2实验部分21仪器与试剂PD15C高效液相色谱仪岛津公司；IFFME型流动注射化学发光分析仪西安瑞迈分析仪器有限责任公司；B5200D超声波清洗机宁波新芝生物科技股份；U1901型双光束紫外可见分光光度计北京普析仪器
8、公司；N500超声波信号发生器上海汗诺仪器。磺胺脒GD、磺胺嘧啶DZ、磺胺噻唑Z、磺胺二甲嘧啶MZ，纯度98%，均购于德国DrEhrenstorfer公司；鲁米诺日本CI公司；甲醇瑞典Oceanpa公司等。甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。GD、DZ、Z、MZ储藏溶液：称取适量GD、DZ、Z、MZ标准品，用40%甲醇配制成10mg/mL的标准储藏液。其中磺胺嘧啶配制过程中参加几滴01mol/LNaO溶液促进溶解，ymbolm4保存。使用时，以纯水稀释至所需浓度。鲁米诺储藏溶液：称取适量鲁米诺标准品，溶于10mol/LNaO溶液中，以超纯水定容。Ag和Ni配合物储藏液分别根据文
9、献19，20制备，AgIO625ymbolm储藏液浓度由其362nm处的摩尔吸光系数=126104Lmolymbolm1cmymbolm1测定得到。根据NiIO62O26ymbolm配合物在410nm处的摩尔吸光系数=106105Lmolymbolm1cmymbolm1测定储藏液中Ni配离子浓度。工作液均用超纯水稀释。22高效液相色谱化学发光检测装置本实验系统由高效液相别离装置和化学发光检测体系装置通过三通接头和聚四氟乙烯管连接而成。液相部分由高压输送泵、进样系统、色谱柱等组成，化学发光部分由蠕动泵、光电倍增管、检测池等组成。实验通路如图1所示：样品由六通阀进样后，经色谱柱别离、进入检测器，与
10、此同时Ag或Ni与鲁米诺溶液经三通阀“5处混合并发生反响，流经三通阀“6时与样品溶液混合，进入检测池检测发光强度。色谱条件：C18色谱柱250mm46mm，5m；流动相01%甲酸甲醇混合液，甲醇用前以微孔有机滤膜045m过滤，01%甲酸溶液用微孔水系滤膜045m过滤，超声脱气；流速：10mL/min；温度：30；进样量：20L。梯度洗脱程序见表1。化学发光条件：试剂流速10mL/min；Ag=1410ymbolm4mol/L；Ni=1510ymbolm5mol/L；NaO=012mol/L；Luminol=1210ymbolm7mol/L；L1=3cm，L2=2cm。23樣品处理根据国家标准方
11、法21，取样品5005mL，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，参加25mL01%ClO4溶液，用水调节至p2，于涡旋振荡器振荡提取1min，超声波萃取10min，备用。LB固相萃取柱依次用3mL甲醇和5mL01%ClO4p2活化，取备用液过柱，再用5mL超纯水淋洗，抽干，用3mL甲醇洗脱。搜集洗脱液，于40氮气吹至02mL，甲醇01%甲酸119，V/V溶液补至10mL，过045m滤膜过滤，待测。3结果与讨论31高效液相色谱条件的优化初步实验说明，在本实验体系中，高效液相色谱有机相的比例对化学发光体系的影响较大，当甲醇或乙腈的有机相的比例过大时，一方面造成PLCCL体系的基线噪声大，且重复性较差，
12、另一方面，由于高效液相色谱装置与化学发光装置通过有机玻璃三通阀连接，甲醇、乙腈等有机溶剂易腐蚀玻璃，对实验设备及实验结果产生一定影响，故在实验过程中应控制高效液相色谱中有机相的比例。PLC法测定磺胺类药物的流动相体系主要有：乙酸乙腈，甲醇磷酸盐溶液等2226。实验发现，乙腈磷酸盐、甲醇乙酸及甲醇甲酸体系均能使4种磺胺类物质得到较好的别离，但结合化学发光体系说明，乙腈较甲醇对化学发光信号的影响较大，乙酸较甲酸对化学发光信号的影响较大，均造成基线不稳定、噪声大等情况，故最终确定流动相为甲醇01%甲酸。进一步研究说明，随着甲醇比例的增大，化学发光信号的基线噪声随之增大。且由于磺胺脒柱上的保存较弱，为
13、使4种检测物质均能在最正确时间内出峰，采用了梯度洗脱程序。综合考虑别离效果及化学发光信号稳定情况，采用表1梯度洗脱程序，流速10mL/min时，4种被检物质均能在25min之内流出，且峰形良好，同时保证了对化学发光信号稳定程度的影响最小。32化学发光条件的优化321化学发光装置流路参数的选择在其它条件一定的情况下，考察了试剂流速对信噪比的影响。结果说明，试剂流速在10mL/min时信噪比为最正确。322Ag和Ni浓度的优化考察了5010ymbolm52010ymbolm4mol/L浓度范围内的Ag和5010ymbolm63010ymbolm5mol/L的Ni配合物浓度对光强及信噪比的影响图2。
14、结果说明，随着Ag和Ni浓度增大，化学发光信号逐渐增大。但随着信号的增强，信噪比随之减小。当Ag和Ni的浓度分别为1410ymbolm4mol/L和1510ymbolm5mol/L时，两体系中被测物质相对化学发光信号较强，信噪比最大，最终确定此浓度为实验最正确浓度。323Ag和Ni配合物溶液中NaO浓度的优化分别考察Ag和Ni配合物溶液中NaO浓度005030mol/L对AgLuminol和NiLuminol化学发光体系相对化学发光强度的影响。结果说明，NaO浓度增加，4种磺胺类药物对两种体系的化学发光强度的抑制作用增强，且噪声随之增大，当NaO浓度为012mol/L时，磺胺类药物对两种体系的
15、化学发光信号的抑制作用最强，且信号稳定，信噪比较大图3。故本实验最终选择Ag和Ni配合物溶液碱度均为012mol/L。324魯米诺溶液浓度的优化在5010ymbolm82010ymbolm7mol/L范围内考察鲁米诺溶液浓度对化学发光信号强度及噪声的影响图4。结果说明，随着鲁米诺浓度升高，相对化学发光强度逐渐增大。但当其浓度为1510ymbolm7mol/L时，基线噪声显著上升，造成信号不稳定，影响峰高，且信噪比逐渐减小。故实验中最正确鲁米诺浓度选择为1210ymbolm7mol/L。33工作曲线、精细度与检出限在优化的条件下，对磺胺类物质系列标准溶液进展测定，回归方程、检出限等参数见表2和表3。检出限的峰高值为3倍的基线噪声/N=3。对样品进展7次平行测定，两体系相对标准偏向分别为10%21%和1019%。34AgLuminol及NiLuminol化学发光机理推断Ag、Ni过碘酸配合物在碱性介质中均为良好的氧化剂，Ag配合物氧化复原电位E=174V26，较Ni配合物的电位高，氧化才能更强。氧化目的物时，Ag反响速度较Ni配合物快，但实验说明，Ni配合物氧化体系更稳定；分别与鲁米诺组成化学发光体系后，Ag体
