酶学与酶工程

《酶学与酶工程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶学与酶工程（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、Lecturel酶学与酶工程1、酶的概念，命名、酶的活性中心1）酶是由活细胞产生的，具有催化活性和高度转移性的特殊蛋白质，是一类生物催化 剂。酶工程：将酶学理论与化工技术相结合，研究酶的产生和应用的一门新的技术性学科， 包括了酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰与改造及酶反应器等方面。主要:酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和酶生物反应器。化学酶工程：用化学手段修饰、改造、模拟天然酶，使其更适合人们的需要，主要包括 天然酶、化学修饰酶、固定化酶以及化学人工合成酶的研究与应用。生物酶工程：用生物学的方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然 酶，创造性能优异的新酶，主要是抗体酶、杂合酶

2、、进化酶和核酸酶的研究与应用。2）命名：系统命名法！催化下列反应酶的命名：ATP+D葡萄糖一ADP+D葡萄糖-6-磷酸该酶的正式系统命名是：ATP：葡萄糖磷酸转移酶，表示该酶催化从ATP中转移一个磷 酸到葡萄糖分子上的反应。它的分类数字是： E.C.2.7.1.1E.C 代表按国际酶学委员会规定的命名第1 个数字（2）代表酶的分类名称（转移酶类）第2 个数字（7）代表亚类（磷酸转移酶类）第3 个数字（1）代表亚亚类（以羟基作为受体的磷酸转移酶类）第4个数字（1 ）代表该酶在亚-亚类中的排号（D葡萄糖作为磷酸基的受体）3）活性中心必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关

3、的基因 酶的活性中心：必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物 特异结合并将底物转化为产物。2、酶的分类、组成、结构特点和作用机制 分类：按酶促反应的性质分类（六大类）：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶类、异构 酶类、合成酶类 全酶=酶蛋白+辅因子 辅因子包括：有机辅因子（辅酶非共价结合/辅基非共价结合或共价结合）和金属辅因子（金 属酶/金属激活酶）酶蛋白的分类：单体酶、寡聚酶仅有一个活性中心的酶；一条/多条多肽链组成，分子量相对小。多酶复合体体内一些酶聚合在一起，组成一个物理的结合体；第一个酶的产物可 以成为第二个酶的底物。多功能酶在酶分子中存在多种催化活性的部位

4、；相关的化学反应在一个酶分子 上进行。3、酶作为催化剂的显著特点 强大的催化能力：可以加快至1017倍； 没有副反应，酶在较温和的条件下催化反应的进行； 高度的专一性，各种酶都有专一性但是专一程度的严格性上有所差别； 可调节性，包括了抑制剂和激活剂的调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等 易变性，大多数的酶是蛋白质，在极端环境中会受到破坏。4、酶活力的调节 调节对象：关键酶！一般位于代谢反应途径的起始或分支位点；催化单向不可逆反应； 活性较低（限速酶）；是可调节酶。方式：酶活性的调节快速 酶含量的调节缓慢（两种方法：同工酶/控制酶基因的表达和酶分子的降解） 酶的质变：酶原调节，变构调节，

5、共价调节 酶原调节：避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，使得酶在特定的环境中发挥作用；另外 酶原可以认为是酶的储存形式；水解激活是不可逆的。变构调节：代谢物可以和酶分子活性中心之外的部位可逆性的结合，使酶的构象发生改变， 从而改变酶的催化活性。这类酶一般具有四级结构，存在协同效应/含有催化亚基和调节亚 基。共价修饰：酶蛋白肽链在其他酶的催化下，化学集团可以与酶发生可你的共价修饰，影响了 酶的活性。PS：磷酸化与脱磷酸化等。（有级联效应）5、核酶的概念及核酶的应用核酶：化学本质是RNA,催化底物包括RNA、DNA、肽键等，还有的具有RNA连接酶、磷 酸酶等活性。具有反应特异性识别碱基；核酶的催化

6、效率比较低是一种较为原始的催化酶。 PS：核酶是金属依赖酶（特异的结构作用；促进RNA分子的折叠；参与过渡中间复合物的 形成） 作用：核苷酸转移作用；水解反应，磷酸二酯酶作用；磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用； 脱磷酸作用，酸性磷酸酶作用；RNA内切反应，RNA限制性内切酶作用。脱氧核酶:利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA 片段，称为酶性DNA。（根据催化功能的不同可以分为五大类：切割RNA的脱氧核酶、切割 DNA的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、催化卟啉环金 属螯合反应的脱氧核酶）应用：1）核酶可以特异性地识别并结合目标基因，

7、使其断裂失活，从而阻断或降低目标基 因的表达，起到基因沉默的作用； 2）核酶不会对细胞基因组产生任何副作用，因而可以作 为安全有效的分子生物学工具； 3）可以应用于基因治疗核酸酶：指所有可以水解核酸的酶,本质为蛋白质。在细胞内催化核酸的降解。可分为DNA 酶和RNA酶；外切酶和内切酶；其中一部分具有严格的序列依赖性，称为限制性内切酶6、同工酶的概念原级同工酶：同一种属中由不同基因或（复）等位基因编码的多肽链多组成的单体、纯聚体 或杂交体，其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称为同工酶。不同基因可以是在 不同染色体或在同一染色体的不同位点上，分子结构差异，彼此间无交叉免疫。次生性同工酶：由

8、同一基因、同一 mRNA转译生成原始的酶蛋白，再经过不同类型的共价 修饰（如糖基化等）而造成的多种酶分子形式，严格来说不属于同工酶而称为次生性同工酶。Lecture2 酶促反应1、酶促反应的特点和机理：极高的效率；特异性（绝对特异性、相对特异性、立体结构特异性）；作用条件 温和；具有可调节性。2、三个假说：锁匙假说关于专一性的假说之一；1894年费歇尔提出；酶与底物的结合方式 可用锁匙结合（多位点结合）假设做出解释；酶是刚性结构的。诱导契合假说1959年D.E.Koshland提出；底物与酶结合时，酶分子上某些基团发生明显的变化；酶的活性中心是柔软的。E+SESE+P中间络合物假说Henri和

9、Wurtz提出；底物浓度与反应速度的关系时发现。酶的咼效 催化是由于酶首先与底物结合生成不稳定的中间产物，然后释放反应 产物和酶。3、酶促反应动力学：1）影响酶促反应的因素，Km值的意义 Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一般时的底物浓度；Km表示酶与底物分子 的亲和力，值越大亲和力越小。 当反应条件恒定时， Km 只和酶及底物的性质有关，与酶的浓度无关； 一种酶能催化几种底物时就有不同的Km，其中Km最小的底物一般认为是该酶的天 然底物或最适底物； 分辨同工酶：测定几个同工酶对同一底物的Km,可估计这组同工酶是原级同工酶还 是次生性同工酶，前者的Km常有差异，后者的则比较接近或相同。有助于

10、寻找限速步骤；在进行生化试验时根据米氏公式计算工具酶的用量。2）有哪些抑制类型，与 Km 之间的关系不可逆性抑制作用抑制剂以共价键与活性中心的必需基团相结合使酶失活;常 见不可逆抑制剂：碘乙酸、有机磷化物分为Ks和Kat两大类可逆性抑 制作用竞争性抑制抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从 而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。Vmax不变，表观Km f非竞争性抑制抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间 无竞争关系。酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产 生产物Vmax&，表观Km不变。反竞争性抑制抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。 酶

11、-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产生产物，常见 于多底物反应中；Vmax/，表观Km 表抑制娄型及其特征的比较刍式v1Bnl斜略酶抑制剂的应用：医学上：青霉素类药物的应用无抑制刑（正常Vnx(S)vITiaiKJ VinQI农业生产上：农药杀虫的机理1厂r-T一一抑制生物体中的靶酶；hm - S|工业上的应用：食品加工过程中宽争性抑制刑V wiSf不变増人増尢使用金属螯合剂抑制多酚氧化Jfmfl +|l Ki + |S|酶。非卷争性抑制剂.v|S|i 小不变1 (1 +l| KOI+ |S|增人反竟争性抑制剂V|T1HsI减小减小心0|S|4、影响酶促反应的因素：1) 底物浓度2) 酶

12、浓度3) 温度4) pH5) 激活剂(必需激活剂/非必需激活剂)6) 抑制剂(使酶的催化活性下降但不引起变性的物质) 5、酶活性的测定和酶活性单位酶的活性单位：在规定条件下，酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量 的底物所需要的酶量。国际单位，在特定条件下，每分钟催化lumol底物转化为产物所需的 酶量为一个国际单位。催量单位，在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需要的 酶量。1IU=16.67x10-9at方法：选择适宜的底物 确定酶催化反应的温度， pH 值，底物浓度，激活剂浓度等反应条件 在一定条件下，将一定量的酶与底物混合液混合均匀，适时记录反应开始的时间 反应到一

13、定时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，检测产物的生产量和 底物的减少量Lecture 3 基因工程的酶学基础&基因克隆表达的过程1、基因克隆常用的酶、应用及注意事项2、重组 DNA 技术操作的主要步骤3、酶工程：酶的生产、改性和应用的技术过程Lecture3 ZFN、TALEN、CRISPER 技术原理及优缺点ZFN锌指蛋白+Fok1识别DNA的酶和Fok1核酸内切酶锌指蛋白结构域负责识 别靶位点，依赖FokI的作 用打DNA双链，从而造 成双链断裂，断开的双链 DNA在修复过程中会发 生碱基的缺失、插入、同 源交换等突变。不是任意二联碱基组合 都有对应的模块；上下文 效应；脱靶现象

14、严重；难 度大TALENTALEN 蛋白+Fok1TALE的核酸识别单兀为 间隔32个恒定氨基酸序 列的双连氨基酸(RVDs)。RVDs 与 A、G、C、T 有恒 定的对应关系，即NG识 别T， HD识别C， NI 识别A， NN识别G/ATALE的核酸识别单元与 A、G、C、T有恒定的对 应关系。靶序列识别模块不受上 下游影响，特异识别并打 断基因组中的任意靶序 列。无基因序列、细胞、 物种限制。毒性低、脱靶 情况少。成对的TALE识别模块保 证了基因敲除靶点的准 确性。CRISPER靶向要求：PAM为NGG如果目标序列不存在只需要合成一个sgRNA 就能实现对基因的特异PAM,则不可用。又

15、需十余 个碱基的精确配对，降低 切割特异性。是一种原核 系统，针对真核细胞中染 色体的各种修饰结构是 否能够无差别的进行高 效的切割还需要进一步 探究。和ZFN及TALEN 一 样，存在双链断裂之后非 同源末端连接修复可能 随机产生细胞毒性的问 题。性修饰，Cas蛋白不具有 特异性;编码sgRNA的序 列小；细胞毒性小，脱靶 率低，便于操作和调节。Lecture5 酶的发酵生产Lecture6 酶的分离纯化6.1 了解酶在细胞中的分布6.1.1 胞外酶：由细胞产生后分泌到胞外发挥作用的酶，大部分属于水解酶，通常含量高容 易得到。6.1.2 细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，该类酶在细 胞内往往与细胞器结合，不又有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性6.2 材料的获取微生物作为酶源的优越性：价格低廉 酶稳定性好；利于分离纯化。6.3 分离纯化的技术路线：产