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1、1外周血CD3+、CD4+/CD8+淋巴细胞比值测定分别于免疫后（7 d、14 d、21d、28d和35d）每组选取6只鸡，每只心脏无菌 采血1.5 ml/只（0.2ml肝素抗凝），由于2ml的血液分离出来的淋巴细胞数目不够， 所以把两只鸡的血液混合后分离淋巴细胞。在无菌环境下，用等量PBS液稀释， 小心叠加于3ml淋巴细胞分离液面上，2 000 r/min离心25min，收集中间云雾层， PBS液洗涤两次，每次2000 r/min离心5min，用PBS调整细胞浓度至1x107个 /ml，加入50卩1的细胞到1.5ml的离心管中。分别加入荧光标记的抗体FITC-CD3（每 106细胞lyg）、
2、PE-CD4 （每106细胞O.lyg）及PECY5-CD8 （每 106细胞O.lyg）共 10卩1，按照上述方法操作，同时做阴性对照（同型对照）。4C避光孵育30min 后，在4C条件下，2000 r/min离心5min，弃去上清液，按照上述方法用PBS洗 涤2次，调整其体积为500卩1，用FACSCahbur流式细胞仪检测。2血液淋巴细胞活性的测定使用按照3.2步骤常规制备鸡淋巴细胞，使其终浓度为0.5x106个/ml或0.25x106 个/ml，铺于96孔细胞培养板中。每孔加入100吐细胞悬液、用完全培养基补足 2001/孔，每个样品设6个重复孔,5%CO2、37C培养44 h后，每孔
3、加入MTT 10pl （5yg/m1），继续培养4 h。吸出150山上清，加入150plDMSO，混匀。用酶联 免疫检测仪，于OD570nm波长，测定吸光度。3疫苗抗体水平测定分别于免疫前（0d）和免疫后（10d、17 d、24d、31d、38d），固定选取30 只鸡，采血1 ml，37C放置2h后，4C冰箱放置过夜。3000r/min离心10min，每份 分装为3个离心管。按常规方法用96孔“V”形血凝板进行血凝抑制（HI）试验，血清 抗体的血凝抑制效价以l og2表示。1%鸡红细胞悬液的配制和抗体效价检测方法见中国兽药典2010版第三部附 录12-14。4雏鸡免疫器官指数的测定各组在免疫后38d各随机抽取15只，称重，剖杀摘取法氏囊、脾脏、胸腺。 用滤纸吸去表面的水分后，用分析天平称重，根据与体重之比计算法氏囊指数、 脾脏指数和胸腺指数，计算公式如下：脾脏指数=脾脏重（mg） /体重（g）法氏囊指数=法氏囊（mg）/体重（g）胸腺指数=胸腺（mg） /体重（g）5血清细胞因子IL2的检测用新城疫和禽流感（H9）抗体水平测定中分离的血清检测（10只鸡/组）。
