共聚焦激光显微镜技术

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1、激光共聚焦显微镜技术绪论激光共聚焦显微镜技术(Confocal Lasers Seanning Miccruscope CLSM)是将显微镜技术与激 光技术有效的结合，对具有荧光标记的物的形态及功能，通过计算机控制可以对其单层面进行快 速扫描，也可以对多个层面进行连续光片层扫描。逐层获得二维光学横断面图像，并可通过计算 机三维重组软件支持，获得真三维图像。激光共聚焦显微镜汇集了激光技术、显微镜技术、免疫荧光技术、计算机及图像处理技术、精 密的机械技术等，高、精、尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。使其成为形态学、分子细胞 生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。我们大家

2、知道，从人类制作的第一台显微镜到现在以有几百年的历史来了，随着人类对生命科 学研究的不断深入，各种显微镜应运而生，使得研究细胞的手段以更加精密化和多样化。共聚焦 显微镜的理论是在1957年Marvin Min sky提出的 但共聚焦显微镜作为商品推出是在20世纪80 年代初期，早期的激光共聚焦显微镜在技术上很不完善，其应用也受到限制。至到20世纪80年 代末，光学系统设计不断改进，成像的质量和灵敏度都有所提高，进入90年代初，激光共聚焦显 微镜系统中逐步引入混合激光和紫外激光技术。90 年代末由美国 Meridian 公司推出的新型激光 共聚焦显微镜系统，已具备完善的光学系统，模块化的仪器设计

3、，灵活的软件和高配置的计算机 硬件，从而使共聚焦显微镜系统的功能不断升级，应用的领域不断扩展。随着生命科学研究的不 断深入及荧光探针技术的迅速发展，共聚焦显微镜将推动生命科学研究的迅速发展，同时生命科 学研究的进展也将使激光显微镜技术不断改进和完善。激光共聚焦显微镜是现今最为先进的光学显微镜，其主要优点为：以激光为光源，在相应的 荧光探针标记后，对样本进行逐点扫描，逐层获得二维光学横断面图像，具有“细胞CT”的功能， 并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图像，并可以任意角度旋转，观察细胞，组织立体形态和空间关系；可以对活细胞和组织进行无损伤的观察，动态测量细胞内的 Ca 离子浓度和pH

4、值等活细胞生理信息；可对细胞膜的流动性，细胞间通讯，细胞融合，细胞骨架弹性测量等，可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。这一技术使得对活细胞和组织进行原位，动态，定量的观 察和测量的梦想成为现实。第一章 光学显微镜显微镜的基本原理 我们大家知道，“工欲善其事，必先利其器”光学显微镜不仅是发现细胞的必要手段，也是生命科学 研究基本技术条件。第一节 普通显微镜的基本结构和原理 普通显微镜利用光线照明，标本中的各点以其光吸收（即光的振幅发生变化）的不同而在明亮的背景 中成像。它是由光学系统；机械系统；光源组成。（一）光学系统1 目镜 它是插在目镜筒顶部的镜头，由一组透镜组成，可以使物镜成倍地分辨、

5、放大物像，例如 10X、15X 等。按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目 镜（或称广角目镜）两类。较高档显微镜的目镜上还装有视度调节机构，操作者可以方便快捷地对左右 眼分别进行视度调整；此外，在这些目镜上可以加装测量分划板，测量分划板的象总能清晰地调焦在 标本的焦面上；并且，为了防止目镜被取走以及减少运输中被损坏的可能性，这些目镜可以被锁定。2 物镜 它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放 大倍数，主要有 10X、20X、40X、60X 100X 等。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面 和标本片的上表面之间填

6、充折射率为 1.4 左右的液体（如杉木油），它能显著的提高显微观察的分辨 率。物镜的主要参数：放大率 放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值。是物镜和目镜放大倍数的乘积。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相 信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。数值孔径：数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能 高低的重要标志。其数值的大小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径（NA ）是物镜前透 镜与被检物体之间介质的折射率（h ）和孔径角（u ）半数的正玄之乘积。用公式

7、表示如下：NA=hsinu/2 孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大， 进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想 增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率h值。基于这一原理，就产生了水 浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率h值大于一，NA值就能大于一。数值孔径最大值为1.4，这个 数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所 以NA值可大于1.4。这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值 应等于或略大

8、于物镜的NA值， 数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正 比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。分辨率： 分辨率又称“鉴别率”，“解像力”。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。显微镜的分辨率用公式 表示为：d=l/NA式中d为最小分辨距离；I为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率 是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则d值越小，分 辨率就越高。要提高分辨率，即减小d值，可采取以下措施1 降低波长I值，使用短波长光源。2 曾大介质h值和提高”人值（N

9、A=hsinu/2 ）。3增大孔径角。4增加明暗反差。焦深： 焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都 可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。 焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数 有以下关系：1焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。2焦深大，分辨率降低。视场直径(Field of view ):观察显微镜时，所看到的明亮的原形范围叫视场，它的大小，是由目镜里的视场光阑决定的。视场直 径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体

10、的实际范围。视场直径愈大， 愈便于观察。1视场直径与视场数成正比。2增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍 物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。覆盖差： 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后 的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm,许可范围在0.160.18mm.,在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标科的确0.17,即表明该物镜要求盖玻片的厚度。工作距离： 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜

11、的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的 一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。3光源 ：有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。4聚光器： 包括聚光镜、孔径光阑。聚光镜由透镜组成，它可以集中透射过来的光线，使更多的 光能集中到被观察的部位。孔径光阑可控制聚光器的通光范围，用以调节光的强度。（二）机械装置1 机架 显微镜的主体部分，包括底座和弯臂。2 目镜筒 位于机架上方，靠圆形燕尾槽与机架固定，目镜插在其上。根据有否摄像功能，可分为

12、双目镜筒和三目镜筒；根据瞳距的调节方式不同，可分为铰链式和平移式。3. 物镜转换器 它是一个旋转圆盘，上有35个孔，分别装有低倍或高倍物镜镜头。转动物镜转 换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路。4. 载物台 是放置玻片的平台，其中央具有通光孔。台上有一个弹性的标本夹，用来夹住载玻片。 右下方有移动手柄，使载物台面可在 XY 双方向进行移动。5. 调焦机构 利用调焦手轮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，从而使被观察 物体对焦清晰成像。6. 聚光器调节机构 聚光器安装在其上，调节螺旋可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱。 第二节 光学显微镜的分类光学显微镜有多种分类方法： 按使用目

13、镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微 镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等； 按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码 （摄像）显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。第二章 荧光显微镜的基本结构和原理第一节 荧光显微镜的基本结构和原理荧光显微镜是利用较短波长的光是样品受到激发，产生较长波的荧光，可用来观察和分辨样品中 产生荧光物质的成分和位置。任何一种荧光物质都有的有的吸收光谱和发射光谱，荧光发射光谱 比吸收光谱

14、的波长偏长波方向，但二者有部分重叠。荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光 365 或紫 蓝光 420）作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜 的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细 胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件 （如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等）的基础上组成的。荧光光源般采用超高压汞灯（50 200W），它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一产生最强荧光的激发 光波长 ，所以需加用激发滤片（一

15、般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激 发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出 较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专性，般都比激发光弱，为能观察到专的荧光，在 物镜后面需加阻断（或压制）滤光片。它的作用有二：是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰 荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专的荧光色彩。两种滤光片必须选择 配合使用。（）光源高压汞灯或氙灯是常用的荧光激发光源，汞灯在366nm、405nm、436nm、546nm、577nm 处有很强的发射线；氙灯也在光的紫外区、可见区有较强的发射线。（二）光学系统（1）物镜 由

16、于激发标本和收集荧光都是由同物镜实现的，所以物镜的选择尤为重要，我们选择 的标准是能透过紫外光的特制物镜，荧光效率与所用物镜数值孔径的 4次方成正比，所以用数值孔径 较大浸油物镜效果较好。（2）目镜 荧光亮度与目镜放大倍数的平方成反比。（3）激发滤片 放置于光源和物体之间，其作用是选择适宜于激发欲观察荧光物质的波长范围。（4）阻断滤片 采用长波通滤片，即使长于某波长的光通过，短于某波长的光不能通过，进一步使荧光与激发光分离，已获更纯的荧光。内阻断铝片以固定在内部，外阻断滤片可跟需要装入或卸下。（5 ）双色反色镜 他放置方向与激发光的方向呈45，具有一个特定波长值m。波长长于m的光 被透射，波长短于 m 的光波被反射，所以它是初分离激发光（较短波长）和发射荧光（较长波长） 的一个重要组件。第二节