农杆菌感受态的制备和转化

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1、1. 农杆菌感受态的制备感受态制备溶液:8% PEG 4000, 4% DMSO,50mM CaCl220Mm 重悬细胞效果更好？挑取农杆菌（EHA105和LBA4404）单菌落接种于含氯霉素或链霉素和利福平5mLYEB液体 培养基中,28C,200250r/min振荡培养3036h，转入100mLYEB液体培养基中（1:20比例接 种），在相同条件下培养至菌液OD600=0.4-0.6（约10h）。然后冰上放置菌液15min, 4C,4000r/min离心10min，用适量50mmol/L冰浴CaCI2溶液 重悬后在相同条件下离心，再用1/10原体积50mmol/L冰浴感受态制备溶液重悬，用

2、1.5mL离 心管分装成50p L小份，置于冰上，液氮速冻之后现用或-80C保存备用。Not Iike E.coli cells, fresh A.bacterium competent cells had higher transformation efficiency . Astimewenton . the transformation efficiency was decreased. When the storage time was longer than7 days and the temperature is higher than 4C, A. bacterium lost

3、the competent ability.2. 冻融法转化农杆菌50p l农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.11p g（5-10ul）,与质粒混合均匀之后，放 置冰上30 min，然后置于液氮速冻3-5min,28C水浴热激5min,然后加入无抗生素的LB培养 基，28C, 200250r/min振荡培养2h,涂布抗性平板，28C静置培养36小时后挑菌落鉴1. 根癌农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备1）挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中， 28C， 200rpm,过夜；2）取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0

4、.5左右；3）将培养物冰浴30min， 4C， 5000rpm，离心5min，弃上清；4）用 l0mL 0.lmol/L 冷的 NaCl 悬浮菌体；5）4C， 5000rpm，离心 5min，弃上清；6）1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80C保存。2. 冻融法转化农杆菌1）冰浴融化农杆菌 LBA4404/GV3101 感受态细胞；2）加入3ul表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1 min，然后在37C水浴5min；3）加入950uL无抗生素的YEP培养基，28C，200rpm，振荡培养4h；4）1 0000rpm离心1 min以浓缩菌液，用100uL YEP回溶菌体；5）将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基 上, 28C培养36-48h。菌液PCR检测阳性克隆。