细胞染色专题之一：台盼蓝

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1、细胞染色专题之一：台盼蓝台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14）： 一种死细胞染色用色素 化学名：3,3-3,3-Dimethyl（1,1-biphenyl）-4,4-diylbis（azo）bis（5-amin o-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonicacid）,tetrasodiumsalt3,3 -3,3-二甲基-（1,1-二苯基）-4,4-二基双（偶氮）-双（5-氨 基-4-羟基-2,7-萘二磺酸），四钠盐分子式：C34H24N6Na4014S4 分子量：960.81CAS Number： 72-57-1 外观：黑褐色结晶粉末

2、摩尔吸光度：69,000（在606nm附近）染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的 DNA 结合，使 其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来 说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性， 通常认为细胞膜丧失完整性，即可 认为细胞已经死亡。这被称为染料排除测试（dye exclusion），ErythrosinB（红 色）、negrosine、eosin Y、AO和EB也用于此目的。通过显微镜很容易就能识 别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。台盼蓝主要用来鉴定原代培养

3、细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼 蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。应用于细胞凋亡：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如 果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。尽管在凋亡的 早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一 定的帮助。储存条件：常温保存注意事项：1. 台盼蓝对人体有毒2. 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。3. 台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。 因为要消化，有时，96 孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的

4、 方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说， 该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。细胞染色专题之二：美蓝美蓝英文名： Methylene blue，Swiss blue 中文名：亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱 性亚甲天蓝等。分子式：C16H18ClN3S分子量：319.85 g/molCAS Number：61-73-4EINECS Number： 200-515-2熔点：100 C沸点：分解吸收峰：668nm和609nm。染色原理：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母 活细胞染色时，由于细胞的新

5、陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能 使 美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原 能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵 母 细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。细胞染色专题之三：吖啶橙吖丫啶橙：N,N,N,N-tetramethylacridine-3,6-diamine 中文名：3,6-双（二甲基氨基）吖啶英文名： AcridineOrange（ AO），Euchrysine，3,6-Acridinediamine，Waxoline Orange A，Acridine Orange Base，Solvent Or

6、ange 15，Rhoduline Orange， Rhoduline Orange N，Acridine Orange NO，Rhoduline Orange NO，Basic Orange 分子式：C17H19N3分子量：265.35 g/molCAS number：10127-02-3 外观：橙色、红棕色粉末 染色原理：吖丫啶橙（AO）与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。AO还可与单链DAN或 RNA形成发红色荧光 的复合物。一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出 最大波长为526nm （激发502nm）的绿色荧光。一个AO分子与单链DNA或RNA 的一个磷 酸基相互作用形成聚集或

7、堆叠的结构，此结构发出最大波长为 650nm （激发460nm）的红色荧光。因此，AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA 或RNA。它使得用氩激光激发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能。 光谱数据：与DNA作用时和荧光素相似，激发最大波长502nm,发射最大525nm（绿光）。 于RNA作用时，激发最大波长移动到460nm （蓝光）,发射最大移动到650nm （红 光）。染色程序：1. 用PBS或合适缓冲液制备10-50 口 M AO溶液。a）2. 将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。b）3. 37C下孵育细胞10-20分钟。4. 用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次

8、。5. 用带有500nm激发和530nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。a) 由于AO可能具有致癌性，因此操作过程中须格外小心。b) 可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基。 储存条件：避光, 冷藏保存细胞染色专题之四：碘化丙啶碘化丙啶 英文名： Propidium iodide, Propidium diiodide; PI 分子式：C27H34I2N4分子量：668.39 外观：红棕色粉末 应用：DNA染色 染色原理：碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧 光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常 被用 来与Calcein-

9、AM或者FDA等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细 胞染色。光谱性质：PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。 染色过程：1. 用PBS或适当的缓冲液制备1050 口 M的PI溶液。a)2. 将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。b)3. 在37C培养细胞10-20分钟。4. 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。5. 用535nm激发波长，615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。a) 由于PI可能具有致癌性，请小心操作。b) 也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。 保存条件：4C避光保存对人体有刺激性，请注意适当防护细胞染色专题之五：罗丹

10、明123罗丹明 123： Rhodamine 123 分子式：C21H17C1N2O3 分子量：381外观：橙红色、红棕色固体/粉末溶解性：可溶于DMS0CAS Number：62669-70-9 染色原理：Rh 123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针，容易被有活性的线粒体 摄取，没有细胞毒性Rhl23透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集，发出黄绿色 荧光，可用于对许多种细胞进行染色，包括植物细胞和细菌。由于细胞内 ATP 的量与Rhl23的荧光强度之间有相关性，此化合物被应用于检测细胞内的ATP。 Rhl23还用于癌症研究。光谱性质：lexl em (MeOH) = 505nm534nm.

11、e (505 nm, MeOH) = 97,000. 染色步骤：1. 将 0.4mg Rh123 溶解到 1ml DMSO 中制备成 1mM Rhl23-DMSO 溶液。2. 用载玻片准备细胞。细胞数目应为5X10e4 - 5X10e5个/ml。3孵育该载玻片，用PBS或Hanks液洗涤细胞。4. 用培养基稀释1mM Rh123溶液以制备1-20 口 M Rh123缓冲液。5. 将Rh123缓冲液a)加入载玻片并在37C下孵育30分钟至1小时。6. 去除Rh123缓冲液并用培养基洗涤细胞。b)7. 用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。a) 加入细胞前将Rh123缓冲液放在37C下孵育。b)

12、 洗涤细胞后为了固定，加入10%福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟，接着用 PBS洗涤。储存条件：避光冷藏保存细胞染色专题之六：溴乙锭溴乙锭：Ethidium bromide 化学名：溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶 英文名： 2,7-Diamino-10-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide ，2.7- Diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridiniumbromide，3.8- Diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiniumbromide，3.8- Diamino-5-ethyl

13、-6-phenylphenanthridiniumbromide，Homidiumbromide， EB，EtBr别名：胡溴胺;溴乙胺菲啶;溴乙菲啶分子式：C21H20BrN3 分子量：394.31 g/molCAS number：1239-45-8熔点：260 - 262C(from wiki)性质：从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体，熔点238240C； 20C时溶于20份 水和750份氯仿。染色原理：EB不能穿过活细胞的细胞膜，然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞 核DNA染色。EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团 的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与 DNA

14、 结合并呈现荧光，由于 EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率，所以当电泳凝胶中含 有游离EB时，也可检测出少量DNA。它是一种高灵敏的荧光试剂，也是一种重 要的荧光染料，常用于检测DNA和RNA。EB与DNA结合后 抑制DNA的复制和转 录。光谱性质：EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518nm和605nm。 染色过程：1. 用PBS或合适的缓冲液制备10-50 口 M EB溶液。a)2. 将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中。b)3. 37C下孵育细胞10-20分钟。4. 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。5. 用带有515nm激发波长和600nm发射

15、波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。a) 由于EB可能有致癌性，操作时须十分小心。b) 可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。储存条件：避光, 冷冻保存细胞染色专题之七：曙红Y曙红： Eosin Y 中文名：水溶伊红；四溴荧光黄；朝红；四溴荧光素钠；曙红钠盐；曙红,水溶 性；黄光曙红英文名： Eosine Yellowish，Bromoeosine，Tetrabromofluorescein C.I. name： Acid red 87分子式： C20H6O5Br4Na2分子量： 691.9，性质：以AgNO3滴定Br-，I-，SCN-等时用作吸附指示剂。CAS Number: 17372-87-1MDL number：MFCD00005040Colour Index Number：45380光谱性质：最大吸收524.8 nm；最大激发490 nm染色原理：Eosin Y 为酸性染料，将胞质染成粉红色（嗜酸性），是组织和细胞化学常 用染色试剂之一，常与苏木精（hematoxylin,为碱性染料，将核染成紫蓝色（嗜 碱性）联合使用（HE染色法）。在免疫组织化学实验中，常作为衬染试剂以便 于组织和细胞结构的观察。存储条件：室温避光保存细胞染色专题之八：苏木精苏木精 Hema