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1、放线菌抗生素得发酵及目得产物得提取一、实验目得1 、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法2 、了解与掌握种子制备与摇瓶发酵技术与方法3 、了解抗生素发酵得一般规律与代谢调控理论4 、了解小型发酵罐得基本结构5 、熟悉掌握小型发酵罐得使用方法与保养6、掌握抗生素生物效价测定得原理与方法; . 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关得操作方法。8.掌握放线菌次级代谢物得初步纯化及牛津杯实验得基本原理与操作技术二、实验原理 发酵罐就是进行液体发酵得特殊设备、 生产上使用得发酵罐容积大 , 均用钢板或不锈钢板制成 ; 供实验室使用得小型发酵罐 , 其容积可从约 lL 至数百升或稍大些。一般来说 ,5L 以下就
2、是用耐压玻璃制作罐体 ,5L 以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器与各种电极 , 可以自动地调控试验所需要得培养条件, 就是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需得设备。抗生素 (antibiotics)就是由微生物 ( 包括细菌、真菌、放线菌属) 或高等动植物在生活过程中所产生得具有抗病原体或其它活性得一类次级代谢产物 , 能干扰其她生活细胞发育功能得化学物质、现临床常用得抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成得化合物、放线菌发酵结束后 , 次级代谢物可能与菌体结合 , 工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理 , 释放与菌体结合得次级代谢物 , 并采用加
3、热发酵液 70 ,2 m n 使蛋白凝固 , 所得酸性滤液 , 在经碱处理 , 进一步去除蛋白。抗生素得效价常采用微生物学方法测定, 它就是利用抗生素对特定得微生物具有抗菌活性得原理来测定抗生素效价得方法 , 如管碟法。管碟法就是目前抗生素效价测定得国际通用方法 , 我国药典也采用此法。管碟法就是根据抗生素在琼脂平板培养基中得扩散渗透作用 , 比较标准品与检品两者对试验菌得抑菌圈大小来测定供试品得效价。管碟法得基本原理就是在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管 ( 内径 6.0 0、lm, 外径。00.lm, 高 0. lmm),管内放人标准品与检品得溶液 , 经 161小时恒温培养 ,
4、 当抗生素在菌层培养基中扩散时 , 会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度 , 即扩散中心浓度高而边缘浓度低、因此 , 当抗生素浓度达到或高于 MIC(最低抑制浓度 ) 时, 试验菌就被抑制而不能繁殖 , 从而呈现透明得无菌生长得区域 , 常呈圆形 , 称为抑菌圈。根据扩散定律得推导 , 抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系 , 比较抗生素标准品与检品得抑菌圈大小 , 可计算出抗生素得效价。常用得管碟法有 : 一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典、二剂量法系将抗生素标准品与供试品各稀释成一定浓度比例( :1 或 : ) 得两种溶液 , 在同一平板上比较其抗药活性, 再根据抗生
5、素浓度对数与抑菌圈直径成直线关系得原理来计算供试品效价。取含菌层得双层平板培养基, 每个平板表面放置4 个小钢管 , 管内分别放入供试品高、低剂量与标准品高、低剂量溶液、先测量出四点得抑菌圈直径 , 按下列公式计算出检品得效价。（1）求出 W与 V: ( +UH)(SL+L)( 式 2 、0-1)V=(UH+U)-(SH SL)(式 2、1- )式中 : H:供试品高剂量之抑菌圈直径;UL:供试品低剂量之抑菌圈直径 ;SH: 标准品高剂量之抑菌圈直径 ; : 标准品低剂量之抑菌圈直径 ;（2）求出 :=D ntilog( V/W)(式2、10 )式中 : : 供试品与标准品得效价比 ;D: 标
6、准品高剂量与供试品高剂量之比, 一般为:高低剂量之比得对数, 即lo2 或log4。求出Pr:Pr=Ar(式 2。-)式中 :Pr: 供试品实际单位数 ;Ar: 供试品标示量或估计单位甲醛滴定法测定氨基氮含量:水溶液中得氨基酸为两性离子,因而不能直接用碱滴定氨基酸得羧基。用甲醛处理氨基酸,甲醛与氨基结合 ,可形成羟甲基衍生物 ,使 H3+上得 H游离出来 ,这样就可用碱滴定 3放出得 +,从而计算出氨基氮含量。如样品中只含有某一种已知氨基酸 ,由甲醛滴定得结果即可算出氨基氮得含量。如果样品就是多种氨基酸得混合物(如蛋白质水解物 ),则滴定结果不能作为氨基酸得定量依据。甲醛滴定法常用于测定蛋白质
7、得水解程度,随着水解程度得增加 ,滴定值增加 ,当水解完全后 ,滴定值保持恒定。甲基红得变色范围就是H4.46.2, 意思就是说 :1. 其 pH 值在 4。 6、2 区间时 , 呈橙色 ,2。其 pH 值 .4 时, 呈红色 , 因就是靠近酸性强得一边时得颜色 , 故又称之为酸色、3. 其 H值、 2 时, 呈黄色 , 因就是靠近碱性强得一边时得颜色 , 故又称之为碱色二、仪器与材料(一)培养基高氏一号培养基 :可溶性淀粉2 .0 aCl 。 5gKN1、0K PO40、5g MgSO4.7H2O 0、5gFeS4。7H20 、01g蒸馏水1000ml, H 7 。 ,发酵瓶培养基 :淀粉
8、3%,葡萄糖 2%, 黄豆饼粉 2。5%, 蛋白胨 0。 ,酵母粉 0。5%, MgSO4 0。 ,(N4)2S4 0。3%,KH 2P4, 、 3,CaC30。4%, P 、 0。黄豆饼粉4, 淀粉 10g, 酵母粉、25 g ,蛋白胨。 5g,M40.025 , CaCO3 。g,(N4)24O0SO 0.3 g,淀粉酶 (105uml) 、01ml。10 lPH7。、 6可溶性淀粉 2.g,NaCl 。05g,NO3 0。g,K2H 0。05g, gSO4.H2O 0、 5, FeSO4。7H2O 0、00g,加蒸馏水至 100ml,P .4,牛肉膏蛋白胨牛肉膏 (5。0g),蛋白胨 (
9、10、 g), Nal(5g),蒸馏水 (100m),pH7、2、 4发酵罐培养基 ( L):黄豆饼粉80g淀粉200 酵母粉5 g蛋白胨30gM SO40、5 gCaO38g( 4) 6 g?淀粉酶(105u/ml)0、2ml( 二) 流加补料碳源 : 葡萄糖 ( 0%)0ml, 控制 1;20 0*1=20,200ml氮源 : 硫酸铵 (10 ) 50ml, 控制 16调 PH值: .1MHl0。 MNaOH( 三) 分析指标及方法所用试剂及溶液测残糖 DNS法1. 3,5 二硝基水杨酸试剂 (NS 试剂 ):将 6。g 得 3,5 二硝基水杨酸与 2mlNaO 溶液加到 500m含有 1
10、82g 酒石酸钾钠得热水溶液中 ,再加 5g 结晶苯酚与 5g 亚硫酸钠 ,搅拌溶解 ,冷却后加蒸馏水定容到 0ml2、1。0m m葡萄糖溶液 :称取 1g 葡萄糖 ,加蒸馏水定容到 1L。3.6mo/氢氧化钠溶液 :称取氢氧化钠 24g,加蒸馏水定容到 100ml。4、6moll 得盐酸 :取浓盐酸 49、68ml,加蒸馏水定容到10ml。测残氮得方法甲醛法。甲基红 :0 、1g 甲基红 , 用 95乙醇定容 10m、 . 0 。3o LCL:取浓盐酸 2。48ml,加蒸馏水定容到 1 0ml。3。、0288ml/LN : 称 0、11432g, 定容 100ml。4. 1 酚酞指示剂 :
11、称取 1g 酚酞指示剂粉末、溶于 100ml95乙醇溶液中、5。9 %乙醇 : 取乙醇 96ml, 倒入 10ml 容量瓶中定容值100l 、6. 1 %中性甲醛 : 取 48ml 38%得甲醛加入小于 10ml 容量瓶 ,往溶液中加两滴酚酞用氢氧化钠滴定刚好变红, 定容到 100ml。（四）器材玻璃试管、试管架、吸管 (1 l,2ml,10 l) 、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、 三角瓶 ( 0 m ,500ml) 、量 筒 (250ml, 00ml,1000ml) 、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲 ( 针) 、振荡培养箱、恒温箱、台秤、 5L发酵罐 , 无菌室、培养皿 ( 直径 cm
12、)、陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、 灭菌刻度吸管、 玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台 , 无菌培养皿, 酒精灯 , 牛津杯 , 镊子 , 移液器等等 ( 五) 、生物效价测定所需材料(1) 菌种 : 大肠杆菌 ( Escheric ia li ), 菌液浓度约为 106 个 m 。菌株保存得时间过久 , 影响其对抗生素得敏感度 , 导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯 , 也会造成这样得结果。因此 ,菌液在使用一段时间后, 可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中得稀释倍数、(2) 抗生素标准品与供试品 : 头孢拉定标准品与供试品。( ) 培养基 : 效价检定用培养基1 号。(4) 无菌缓冲液 : 称取磷酸氢二钾 .59 , 磷酸二氢钾、 4 , 加水
