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1、精选优质文档-倾情为你奉上高效薄层色谱法鉴别6种中药多糖杨成，管佳，章江生，李绍平*（澳门大学中华医药研究院，澳门）摘要：目的 鉴别不同来源的中药多糖。方法 采用高效薄层色谱法分析多糖酸水解产物，同时应用2种显色剂以及薄层扫描技术，获得可区别中药多糖的特征图谱。结果 以正丁醇：甲醇：氯仿：冰醋酸：水=12.5: 5:4.5:1.5:1.5(v/v)为展开剂， 7种标准单糖和2种糖醛酸为对照，使用苯胺-二苯胺为糖类成分显色剂，结合茚三酮显色剂检查氨基酸类成分，获得了多糖酸水解产物中两类成分的特征薄层色谱，可用于区分来自冬虫夏草、灵芝、黄芪、人参、西洋参和三七的6种多糖组分。结论 建立了一种可鉴别
2、6种中药多糖的高效薄层色谱法，此法简单快速，经济实用，可以用于多糖类成分质量控制。关键词：多糖，高效薄层色谱，质量控制，中药Discrimination of Polysaccharides from Six Traditional Chinese Medicines using High-performance Thin-layer ChromatographyYANG Cheng, GUAN Jia, ZHANG Jiang-sheng, LI Shao-ping* (Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, M
3、acao SAR, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To distinguish the polysaccharides from different Traditional Chinese medicines (TCMs). METHODS The acid hydrolyzates of polysaccharides were analyzed by high-performance thin-layer chromatography (HPTLC) combined with two coloration methods and thin layer scannin
4、g technique. RESULTS The chromatography was performed on nano silica gel 60 plate with n-butanol -methanol-chloroform- acetic acid-water (12.5:5:4.5:1.5:1.5, v/v/v/v/v) as mobile phase. 7 monosaccharides and 2 glycuronic acids were used as reference compounds. The aniline-diphenylamine solution and
5、ninhydrin solution were employed for detection of saccharides and amino acids, respectively. The polysaccharides from Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Astragalus memberanaceus, Panax ginseng, Panax quinquefolii and Panax notogiseng were easily discriminated based on their characteristic TLC pr
6、ofiles. CONCLUSION A simple, rapid and effective HPTLC method was developed for distinguishing the polysaccharides from 6 TCMs, which is helpful to control the quality of polysaccharides from Chinese medicine.KEY WORDS: Polysaccharides; HPTLC; Quality control; TCMs多糖是一类由单糖（通常大于10个）通过糖苷键连接而成的生物大分子聚合物
7、，是生物体维持生命活动的必需物质。近年来，由传统中药及天然药物中分离得到的多糖类成分，因其广泛的生物活性，如抗肿瘤，调节免疫，抗病毒等1-4已成为多糖研究的热点。然而，如何鉴别不同来源的中药多糖一直是个难题，也是多糖质量控制的关键问题。目前多种现代仪器分析方法，如薄层色谱5、气相色谱6、高效液相色谱7、质谱8、核磁共振9等已应用于多糖的结构分析中，其中薄层色谱因其简单、快速、样本量大、成本低等优点已成为单糖、寡糖成分鉴别的常用方法5。本文应用高效薄层色谱（HPTLC）法对6种常用中药多糖的酸水解产物进行分析，以7种单糖和2种糖醛酸为对照，采用2种不同的显色剂对组成糖类成分及结合氨基酸类成分分别
8、显色，获得了可用于鉴别的特征薄层色谱。1 仪器与试药Desga 高效薄层系统（含AS30自动点样器，CD60扫描仪，Pro Quant扫描软件 德国Desga公司）；双槽展开缸；高效硅胶60板（德国MACHEREY-NAGEL 公司）。微波提取仪 (Multiwave3000, Antonpaar, 奥地利)D-半乳糖，D-葡萄糖，D-核糖，D-木糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖，L-鼠李糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖醛酸(美国Sigma公司); 水（MilliQ 纯水）；其他试剂均为分析纯。人参（Panax ginseng），西洋参（Panax quinquefolii），三七（Panax no
9、toginseng），冬虫夏草（Cordyceps sinesis）购于澳门中侨参茸公司，黄芪（Astragalus memberanaceus）采自山西，灵芝（Ganoderma lucidum）采自安徽金寨，均由通讯作者鉴定。2 方法2.1 对照品溶液的制备取D-葡萄糖0.5 mg，D-核糖1.5 mg，D-木糖1.5 mg，D-甘露糖0.5 mg，L-阿拉伯糖1.0 mg，L-鼠李糖0.5 mg，D-半乳糖醛酸1.0 mg，D-葡萄糖醛酸1.0 mg，精确称定，溶于1 mL 95%乙醇制成混合对照品溶液。2.2 供试品溶液的制备取干燥药材粉末1 g，加入10 mL水，置微波提取仪中于12
10、0 C 下提取15 min，提取液于4500 rpm下离心10 min后取上清液，加入40 mL 95%乙醇后于4 C冰箱内醇沉过夜。混悬液再次离心，弃去上清液，沉淀以5 mL 95%乙醇洗涤2次后冷冻干燥得粗多糖。取粗多糖10 mg溶于5 mL三氟醋酸（TFA），置于氮气保护密封试管内100 C水解2 h。水解液低压旋干，残渣溶于1 mL 50%乙醇得供试品溶液。2.3展开剂和显色剂以正丁醇：甲醇：氯仿：冰醋酸：水=12.5:4.5:5:1.5:1.5(v/v) 展开，苯胺-二苯胺溶液（二苯胺4 g、苯胺4 mL、85%磷酸20mL混合溶解于200 mL丙酮溶液中）和茚三酮溶液（0.2 g茚
11、三酮溶解于100 mL 丙酮中）为显色剂。2.4 薄层层析高效薄层板（20 cm10 cm），点样量10 L，混合对照品点样1 L，样品条带宽10 mm，间隔15 mm，起始点样高度10 mm。点样后薄层板放入已预先饱和30 min的双槽层析缸中展开，展开距离9 cm，取出吹干，喷显色剂苯胺-二苯胺显色后，130 C加热显色至斑点清晰；或喷茚三酮后，105C加热显色至斑点清晰，覆盖同样大小玻璃板，四周用胶布封固后作薄层扫描。3 结果3.1多糖水解条件的优化3.1.1酸的选择参考文献10的方法，以人参多糖为样品分别使用硫酸、盐酸和三氟醋酸进行完全酸水解考察。硫酸水解：10 mg样品加入5mL 1
12、 molL-1硫酸，密封试管100 C下水解4 h，水解液冷却后加入足量碳酸钡中和，4500 rpm下离心10min后收集上清液，沉淀以5 mL 50%乙醇洗涤后再离心，合并上清液。上清液于40 C下低压蒸干，残渣溶于1 mL 50%乙醇备用。盐酸水解：10mg样品加入5 mL 2 molL-1盐酸，100 C水解4 h，水解液冷却后加入NaOH溶液中和，溶液于40 C下低压蒸干，残渣溶于1mL 50%乙醇备用。三氟醋酸水解：水解方法同2.2，水解时间为4 h。结果见图1，由图可见，盐酸水解后因中和步骤产生大量的NaCl，干扰了展开条带；硫酸水解产物可得清晰条带，但因中和步骤繁琐而导致产物损失
13、；采用TFA水解，操作简单，条带多且清晰，产物损失较小，故选用TFA进行多糖水解。图1 多糖水解用酸的选择L1TFA水解；L2硫酸水解；L3盐酸水解；L4混合对照品；1，D-半乳糖醛酸；2，D-葡萄糖醛酸；3，D-半乳糖；4，D-葡萄糖；5，D-甘露糖；6，D-阿拉伯糖；7，D-木糖；8，D-核糖；9，L-鼠李糖Fig1 Selection of the acid for hydrolysis of polysaccharidesL1TFA hydrolysate; L2H2SO4 hydrolysate; L3HCl hydrolysate; L4Mixed standards; 1, D-
14、Galacturonic acid; 2, D-Glucuronic acid; 3, D-Galactose; 4, D-Glucose; 5, D-Mannose; 6 L-Arabinose; 7, D-Xylose; 8, D-Ribose; 9, L-Rhamnose3.1.2 酸浓度的优化以3.1.1中TFA水解的条件，分别使用2、1.5、1 molL-1 TFA进行水解，考察不同浓度TFA对多糖水解的影响。结果如图2，由图可见，随酸浓度降低，水解不完全，释放出的半乳糖醛酸（条带1）减少，且条带3下方条带（可能是未水解寡糖）增多，干扰糖醛酸检测，因此酸浓度选用2 molL-1。图2
15、三氟乙酸浓度的优化L12 molL-1；L21.5 molL-1；L31 molL-1；L4混合对照品；19，同图1Fig 2 Optimization of TFA concentration for the hydrolysisL12 molL-1; L21.5 molL-1; L31molL-1; L4Mixed standards; 19，same as in Fig 13.1.3水解时间的优化以3.1.2中确定的TFA水解条件，分别考察4 h、2 h、1 h等不同水解时间。结果如图3，由图可见，1 h时水解不完全，条带3下方可见明显未水解寡糖条带，干扰糖醛酸检测，2 h与4 h水解效
16、果相近，因此选择水解2 h。图3多糖酸水解时间的优化L14h；L22 h；L31 h；L4混合对照品；19，同图1Fig 3 Optimization of TFA hydrolysis time L14 h ; L22 h; L31 h; L4Mixed standards; 19，same as in Fig 13.1.4 重复性考察以3.1.3中所确定的TFA水解条件，取3份人参多糖样品平行水解，考察重复性，结果如图4，表明本水解条件重复性良好。图4水解重复性考察L1L3，3份平行水解样品；L4混合对照品；19，同图1Fig 4 Repeatability for acid hydrolysis
