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1、西兰花酶蛋白联合测定法1 包括：(1) 可溶性蛋白(soluble protein),(2) 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase), SOD(3) 过氧化物酶(peroxidase), POD(4) 丙二醛(malondialdehyde), MDA过氧化氢酶(catalase), CAT2 联合测定的原因：(1) 节省人力,节省提取研磨过程(2) 节省待测样品3 联合测定的可行性：(1) 汪俏梅，郭得平(2004)对POD、SOD、CAT进行联合测定。取1g西兰花样品，按 1:5(W/V)加入0.05mol/L, pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆于4C, 1300
2、0g离心20min, 上清液为酶提取液，分别测定POD、SOD、CAT活性。(2) 叶陈亮，柯玉琴，陈伟(1996),对可溶性蛋白、MDA、SOD、LOX进行联合测定。称1g花蕾，用含1%聚乙烯吡咯烷酮的50mmol/L, pH7.0磷酸缓冲液4ml与冰浴中研磨匀 浆，15000r/m冷冻离心10min,上清液备用。 取上清液50p l,按Folin-酚法测定可溶性蛋白质含量； 取上清液1.25ml,加水1.25ml和0.5%硫代巴比妥酸三氯醋酸溶液2.5ml混匀，煮沸10min 后离心比色测定，按陈贵推荐公式计算MDA含量； 取上清液10p l,按朱广廉法测定SOD活性，以SOD抑制NBT光
3、化学还原50%所需酶 量为一个酶活性单位； 取上清液0.5ml,按Surrey法比色测定LOX活性，以每分钟增加1个OD值为一个酶活 单位。4 联合测定的缺点( 1 )时间比较紧张,要求合理安排顺序,相互之间溶液干扰； (2)最好是同时做,人员比较多；( 3)仪器,尤其是分光光度计要求要足够,不要相互之间抢；(4)需要标准曲线的最好一起做,它要求所有待测样尽量在同一条件下测定。其它酶也是 么？解决,减少实验次数,集中在1-2 次内完成。做大量的预备实验,熟练技能。达到实验 组每个成员倒背如流。5 方案 想最后都一起测,理由是我们认为可以保证较低温度和酶活性不失活,并且我们保证人员充足,速度达到
4、或接近单个指标的测定。如果大批量同时测的话,分光光度计最多可以得 到3台/4台。复合物的提取（主要是酶）一）冰浴研磨法1 取样，l.Og西兰花花蕾样品2 放入事先预冷的研钵，先加入 2ml 的提取液（先预冷），加入少量石英砂，冰浴研磨至 匀浆3 再加入 3ml 提取液继续研磨4 转移至 10ml 离心管，用 2ml 提取液冲洗研钵，混匀5 冰浴抽提30min,不时的轻摇6 离心，4C, 13000g, 15min7 将上清转移至带刻度的试管，记录每一试管的体积8 将酶液保存在冰浴中，严格保护，备用注（1）提取液总体积为7ml,即选用7倍体积的提取液（2）提取缓冲液成分：50mM磷酸缓冲液pH7
5、5内含（1） PVP1%（2） EDTA2mM,pH8.0（3）0 -巯基乙醇 0.04%（二）液氮研磨法1 取样，1.0g西兰花花蕾样品2 放入事先预冷的研钵,加入液氮,并加入少量石英砂,研磨至粉末,用预冷的药匙将粉末转移至10ml离心管，加入7ml提取液，冰浴保护30min,不时摇匀3 离心，3900rpm, 20min,尽量保持在低温4 将上清液转移至10ml量筒，记录体积，转移至10ml离心管，低温保护备用第一部分 可溶性蛋白含量的测定考马斯亮蓝（G-250）法一、原理考马斯亮蓝G-250 （Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的
6、一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大吸收在488nm,当它与蛋白质结合后变为青色， 蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其吸光值与蛋白质含量成正比，因此可 用于蛋白质含量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间达到平衡，完成 反应非常迅速；其结合物在室温下1小时内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂 配制简单，操作简便、快捷，反应非常灵敏。灵敏度比 Lowry 法还高 4 倍，可测定微克级 的蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000|J g/ml,是一种非常常用的微量蛋白快速测 定方法。二、试剂配制1 牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取l
7、OOmg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，即为lOOOp g/ml的原液(4C保 存)。2 蛋白染色剂一考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mgG-250,溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85% (w/v)的磷酸，最后定容至 1000m 1。此溶液在常温下可保存1个月。注意：(1) 乙醇可用无水乙醇配，无水乙醇与 95%乙醇价格差0.5元左右；(2) 磷酸本身浓度为 85%。三、标准曲线的制作1 标准曲线的制作(1)0100p g/ml标准曲线的制作取 6 支 10m1 干净的具塞带刻度的试管，按表一取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒 转混合，放置2min后，用1cm光径的比色杯
8、在595nm波长下比色，记录各管测定的光密 度 OD 值，并做出标准曲线。表一 0100标准曲线管号1234561000M g/ml 母液(ml)00.020.040.060.080.10DH2O(ml)1.000.980.960.940.920.90G-250 试剂(ml)555555蛋白质含量(M g)020406080100OD250(2)01000|J g/ml标准曲线的制作取6支10ml具塞试管，按表二取样。其余步骤同(1)操作，做出蛋白质浓度为01000 M g/ml的标准曲线。表二01000m g/ml标准曲线管号1234561000M g/ml 母液(ml)00.20.40.6
9、0.81.0DH2O(ml)1.000.80.60.40.20.0G-250 试剂(ml)555555蛋白质含量(M g)02004006008001000OD250(3) 0150M g/ml 标准曲线的制作取6支10ml具塞试管，按表三取样。其余步骤同(1)操作，做出蛋白质浓度为0150 M g/ml 的标准曲线。表三0150|J g/ml标准曲线管号1234561000M g/ml 母液(ml)00.030.060.090.120.15DH2O(ml)1.000.970.940.910.880.85G-250 试剂(ml)555555蛋白质含量(M g)0306090120150OD25
10、03 样品提取液中蛋白质浓度的测定取2支试管（10ml具塞，作为2个重复），按下表加样:表3管号1314待测样品（ml）0.080.08DH2O(ml)0.920.92G-25055OD595蛋白质含量四、计算结果X x V 样品中蛋白质含量（“g/gFW） =0W x V1其中X为在标准曲线上查得的蛋白质含量，p g； Vo为提取的总体积，ml； V1为测定 蛋白质时所用的体积， ml； W 为样品鲜重， g。第二部分 超氧化物歧化酶的测定参考李合生、孙群、赵世杰、章文华编的植物生理生化实验原理和技术167 页一、原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，简称SOD）是需氧
11、生物中普遍存在的一种含金 属酶，它能够防御活性氧或其它过氧化自由基对细胞膜系统的伤害，因此，其活性与植物抗 性密切相关。SOD2O-+2H2 2 2CATH2O2 2H2O+O22 2 2 2依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有 氧化物质存在的条件下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条下极易再氧化而产生 02-，02-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm出有最大吸收。而SOD可清除 02-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反 之酶活性愈高。根据此可算出酶活性的大小。二、试剂1 130mmol/L甲
12、硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。2 750p mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。3 100p mol/LEDTA-Na 溶液：称取 0.03721g EDTA-Na，用磷酸缓冲液定容至 1000ml。4 20p mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素蒸馏水定容至1000ml，避光保存。三、实验步骤1 SOD的提取，使用联合测定法提取的酶液。2 显色反应取5ml指形管（或试管，要求透明度好）4支，2支为测定管，2支为对照管，按下表 1 加入各溶液：表 1 溶液显色反应用量试剂（酶）用量（m
13、l）终浓度0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet 溶液0.313mmol/L750p mol/LNBT 溶液0.375p mol/L100p mol/LEDTA-Na?0.310p mol/L20p mol/L核黄素0.32.0p mol/L酶液0.102 支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.20总体积3.0混匀后将1支对照管放置暗处，其它各管于40001X日光下反应15min （要求各管受光 情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。3 SOD 活性测定与计算 至反应结束后，并将各管遮光放置，以不照光的对照管为空白，分别测定其它各管的吸 光度。二、结果计算已知 SOD 活性单
14、位以抑制 NBT 光化还原的 50%为一个酶活性单位表示，按下式计算 SOD 活性。SOD 总活性=（Ack_ae）X V1-Ack X W X Vt2 cKSOD 比活性=SO !总活性 蛋白质含量式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为cK照光对照管的吸光度；Ae为样品管的吸光度；V为样品液的体积，ml； Vt为测定时样品用 E量，ml； W为鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/go第三部分 过氧化物酶的测定张志良植物生理学实验指导， 1990一、实验目的 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切的关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量 这种酶，可以反应某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握 其测定方法一愈创木酚法。二、原理在过氧化物酶（peroxidase）催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm 处有最大光吸收，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶活性。三、试剂1
