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1、氨基酸自动分析仪氨基酸是蛋白质的组成成份，是蛋白质化学研究的要紧内 容之一。蛋白质是一切生命物质的基础，因此，探讨和揭露 生命现象的发生、生长、新陈代谢、遗传变异进程，都与氨 基酸的研究有关。随着近代物理学、化学和电子学的飞速进展，氨基酸的分 析技术亦在不断更新。氨基酸分析仪是本世纪50年代研制 的，仅40连年，已进展到此刻的进样、分离、检测和数据 处置全数自动化的程度。检出量由微克分子到毫微克分子， 分析时刻由原先的24小时到此刻的半个小时，分析技术的 提高增进了其他科学领域的进展。一、氨基酸自动分析仪的进展用于氨基酸分析的方式很多，有纸色谱法、柱色谱法、薄 层色谱法、电泳法及气相色谱法等。
2、一样以为离子互换柱色 谱法是较为精准的检测方式，氨基酸分析仪确实是在此基础 上研制成功的。1951年Moor和Stein采纳离子互换树脂色 谱，用茚三酮试剂显色和分光光度计检测而设计，后来在 Spaekman的协助下，使分析操作自动化。迄今氨基酸分析仪 的条件和自动程度有了专门大的改观，其特点要紧表现以下 几个方面。1.树脂粒径减小 最近几年来制成的小颗粒球状树脂，使 氨基酸分析仪取得专门大改良。由于树脂粒径减小就对应地 增加等量树脂的总面积，使此刻少量树脂达到过去大量树脂 的分离成效，从而减小了树脂柱的内径和体积，节省了试剂 用量，缩短了分析时刻。树脂的粒径从200-20-10-5叽2 .色
3、谱柱内径缩小树脂粒径减小使填充树脂床的色谱 柱内径减小，由过去的粗长柱变成微柱。色谱柱内径的转变 为 18-6-。3.输压泵压力增高 一样氨基酸分析仪采纳低压泵，其施 加于输液的压力只有几X 104Pa，以后增加至几十X 104Pa, 此刻进展到20 68X 104Pa。4 .分析时刻缩短 由于树脂粒径的改善，色谱柱内径缩小 和泵压增高，使分析时刻大大缩短。蛋白质水解液的分析时 刻从过去的24小时缩短到此刻的半个小时左右。5 .仪器灵敏度提高由于仪器的不断改良，使灵敏度大为 提高，过去仪器的最高灵敏度已远不及此刻仪器的最低灵敏 度。此刻一样氨基酸分析仪的灵敏度均达到。6 .试剂用量减少由于分析
4、时刻大大缩短，致使试剂消耗 量大为降低。氨基酸分析的试剂要求纯度很高，且价钱昂贵， 试剂用量减少会降低分析费用，试剂流量（每小时茚三酮试 剂的用量）的转变为70-35-18-。7 .样品用量少 由于仪器灵敏度不断提高，同时很多仪器 采纳单柱分析法，因此样品用量慢慢减少，从过去一次分析 需要样品几ml到此刻只用20闫。这对科研中难以搜集和制 备的样品和许多生物样品的微量分析提供了十分有利的条 件。8 .自动化程度提高 由于采纳多样品自动注入器、程序操 纵和数据处置系统，使仪器从进样到每一个氨基酸结果打印 的全进程都自动化。而且当仪器显现故障时又能自动停机， 因此能够自动地进行工作。9 .显色试剂
5、和检测器的改善显色试剂中除茚三酮仍被 普遍应用外，荧光试剂受到人们的重视。以前以为很有进展 前途的荧光胺已被邻苯二甲醛所取代。目前用邻苯二甲醛的 荧光计检测器检测的灵敏度比用茚三酮显色后经分光光度 计检测的灵敏度高100倍以上。二、氨基酸分析原理1 .氨基酸的理化特性氨基酸是无色的结品物质，氨基酸分子()至少有一个氨基 和一个羧基，在水溶液中呈中性、弱酸性或弱碱性，是两性 电解质，它所带的电荷随介质pH而转变。当氨基酸处于H+ 介质中，羧基的解离作用被抑制，整个分子取得一个质子带 正电荷；反之，当它处于OH-介质中，那么从氨基夺走一个 质子，从而整个分子带负电荷。当处于某一 pH下，两性离 子
6、所带正负电荷数相等时，现在的pH值确实是该氨基酸的 等电点，整个分子呈电中性。一样氨基酸都能溶于水和其他 极性溶剂，而难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等非极性溶剂。由于氨基酸结构不同，等电点亦有不同。氨基酸等电点是 取决于其羧基和氨基的解离常数的相对值。由于羧基的解离 常数大于氨基酸的解离常数，故一样氨基酸的等电点为弱酸 性。由于氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此，它们都能产 生氨基和羧基的一样化学反映，如酯化、甲基化、乙酰化和 酸碱中和反映等。那个地址仅就氨基酸分析仪采纳的与茚三 酮试剂显色反映加以描述。氨基酸与水合茚三酮一起加热被氧化分解为CO2、NH3和比 氨基酸少一个碳原子的醛，现在茚三酮被还
7、原。在弱酸性溶 液中(pH=5)，还原茚三酮与NH3及另一个分子茚三酮缩合成 蓝紫色化合物茚二酮块一茚二酮胺(DYDA)。反映式为：由于DYDA在570nm处有最大吸收峰，因此普遍地用于氨 基酸比色测定。唯脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反映生成黄色 物质，在440nm处有较强的吸收峰。2 .离子互换树脂离子互换色谱是以液体作为流动相，用离子互换树脂装在 柱内作为固定相，与适当的检测器连接起来的专用液相色谱 法。其大体原理与离子互换色谱相同。各类氨基酸的酸碱性、 极性和分子结构不同，经常使用阳离子互换树脂在色谱柱上 分离，可用不同的pH值和离子浓度的缓冲液依次将它们洗 脱，酸性氨基酸先被洗脱下来，第二
8、是中性和碱性氨基酸， 同类型的氨基酸，分子量较小的先洗脱出来。由于氨基酸不 吸收可见光，故洗脱液需与茚三酮反映显色后才能检测，最 后依照检测信号的大小计算各类氨基酸的含量。离子互换树脂有以下类型：阳(酸性)离子互换树脂 凡是含有酸根的树脂为阳离 子互换树脂，这种树脂又可分为强酸型、中强酸型和弱酸型 三类。强酸型含有磺酸基团(一SOH)；中强酸型含有磷酸根 3(-POH)、亚磷酸根(一POH)；弱酸型含有羧基(一COOH)或 3 22 2酚羟基(一OH)。以上这些互换树脂在互换时反映机理如下：阴离子互换树脂 阴离子互换树脂都含有氨基，它可分 为强碱型、中碱型和弱碱型三类，如含季胺盐-N +(CH
9、3)3 为强碱型；叔胺-N(CH3)2、仲胺-NHCHJ、伯胺类为弱碱 型。既含强碱基团也含弱碱基团的互换树脂是中强碱型树 脂。互换反映如下：强碱型 R-N+ (CH3) 3OH-+ClR-N+ (CH3) 3C1-+OH-弱碱型 R-N(CH3) 2+H2OfR-N+ (CH3) 2H+OH-R-N+ (CH3) 2HOH-+C1R-N+ (CH3) 2HC1+OH-以上所列离子互换树脂含有一个分子的不溶基底物质及 一个活性根，但这些活性根的存在会增加物质的溶解度，一 样的方式是在树脂中加入“交联结构”，使它成为一个高分 子量的大聚合物，上下左右索扯固定，不能溶解。氨基酸分析仪所用的强酸型阳
10、离子互换树脂是由苯乙烯 及二乙烯苯合成的，其中苯乙烯是要紧成份，磺酸根联结在 其上，形成磺化苯乙烯。二乙烯苯是用来做交联结构的，它 把直链结构的磺化苯乙烯错综地连贯起来，避免因吸水溶解 而溃散。磺化苯乙烯与二乙烯苯的聚合如下图。利用离子互换树脂应注意交联度，即二乙烯苯占树脂单体 的百分率。交联度大，树脂的结构紧密，间隙度、渗透性和 溶胀性较小，适应于分子量较小的氨基酸分离；反之交联度 小的树脂，结构疏松，间隙度、渗透性及溶胀性大，在离子 互换中结构不稳，高压的洗脱液会把这种树脂破坏，氨基酸 分析所用的树脂交联度为8%12%。目前，国外各厂商都有自己的树脂，配制方式均属专利产 品，因此树脂的售价
11、昂贵。3.氨基酸自动分析仪原理氨基酸分析仪是在离子互换色谱的原理指导下制成的，是 一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪。它的结构一样是由 色谱系统、自动加样系统、检测系统、操纵系统、数据处置 系统组成。如下图，流程图的要紧部件有，进行氨基酸分离 的离子互换树脂色谱柱；分离的各个氨基酸与茚三酮试剂反 映的水浴(100C1C)；用于检测氨基酸显色的比色计及记 录仪和数据处置系统；输送缓冲液和茚三酮试剂的恒流泵； 缓冲液自动转换阀；自动进样器；维持色谱柱分离温度的恒 温水浴。用于氨基酸分析的样品都需用的缓冲液溶解或配制，由于 都较各类氨基酸的等电点小，即各氨基酸都处于H+浓度专 门大的酸性溶液中，如此
12、的溶液有利于氨基酸的氨基（一NH ）2 电离，而无益于羧基（一COOH）的电离。因此，在的缓冲液中 各氨基酸呈R-CH-COOH状态，带正电荷。柱里的磺酸型阳 离子互换树脂R-SO3-H+被柠檬酸钠（生理体液为柠檬酸锂）缓 冲液平稳时形成R-SO -Na+。当带正电荷的氨基酸进入色谱3柱前端，现在氨基酸浓度处于最大值，氨基酸与Na+进行如 下互换：由于缓冲液的流动和氨基酸的吸着，氨基酸在流动相中的 浓度下降，这时氨基酸就会解吸，这种解吸作用使互换树脂 恢复到原先的形式。如此当氨基酸通过离子色谱柱时，持续 地吸着与解吸，加上各类氨基酸彼此性质不同，吸着的程度 就有不同，在缓冲液的作用下便形成了分
13、离。当慢慢提高洗 脱缓冲液的pH值时，氨基酸的正电荷慢慢减少，与树脂的 结合力慢慢减弱，最后从离子色谱柱被洗脱下来。氨基酸的结构不同，与树脂的结合力也有不同。酸性氨基 酸所带的氨基少，正电荷也少，与树脂结合不紧，它容易被 洗脱下来。如天门冬氨酸，是第一个洗脱下来的氨基酸，其 等电点为：天门冬氨酸等电点（pI）二%+二相反，赖氨酸所带的氨基（一NH ）多，在缓冲液中，正电荷2多，它与树脂结合紧密，被Na+置换困难，故洗脱下来的速 度就慢。赖氨酸的等电点（pI）二%+二氨基酸侧链除具有氨基和羧基外，有的氨基酸还带有其他 基团，这些基团在必然条件下也能离解，如酚羟基（酪氨酸）、 咪唑基（组氨酸）及胍
14、基（精氨酸）等，在必然条件下，这些基 团的解离状态及它们对树脂的亲和力和被洗脱的速度是有 区别的，这些区别是各氨基酸在色谱柱被分离的基础。不同氨基酸与离子互换树脂亲和力的强弱如下：碱性氨基酸芳香族氨基酸中性氨基酸酸性及羟基氨基 酸。因此，氨基酸的分离便有前后顺序，一样酸性及带羟基的 氨基酸最先洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基 酸。图是Beckman 121MB型氨基酸分析仪蛋白质水解液中各 氨基酸的出峰顺序。氨基酸的分离是用不同pH值的缓冲液进行的，一样标准 分析（蛋白质水解液分析）采纳柠檬酸缓冲液，若是分析生理 体液（如尿、血浆、乳汁、脑脊液及动植物组织提取液等）那 么该为柠檬酸锂
15、缓冲液，因为天门冬酰胺与谷氨酰胺在钠盐 缓冲液中不易分离，二者重叠成一个峰，不能得出各自的结 果。标准氨基酸分析（蛋白质水解液分析），Beckman 121MB型 一样利用三种缓冲液。即洗出天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、 丙、胱、缬等氨基酸；洗出蛋、异亮、亮、酪、苯丙等氨基 酸；洗出赖、组、精等氨基酸。除以上缓冲液外，还有再生液，浓度为LNaOH。每做完一 个样品，仪器自动吸入再生液，将柱子冲洗干净后，再做第 二个样品。洗脱出来的氨基酸与另一流路的茚三酮溶液混合，在 100C的水浴中起显色反映。一样氨基酸反映后呈蓝色，但 脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色。故氨基酸分析仪一样都设计有二 个频道，一个为570
16、nm，一个为440nm。显色后，流经分光 光度计比色，比色后的信号经放大以后输入记录仪和积分 仪，最后打印出结果。三、氨基酸分析仪的结构与功能氨基酸分析仪是一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪， 其结构一样由色谱系统、自动加样系统、检测系统、操纵系 统、记录数据处置系统、电源供给系统和平安关闭系统组成。1 .色谱系统色谱系统的作用是完成样品中各类氨基酸成份分离。本系 统包括氮气供给、流路和色谱柱、转换阀、泵和水浴等部份。氮气供给氨基酸分析仪需要利用高纯氮（含七量%）。氮气的作用是 避免茚三酮试剂被空气中的氧所氧化；避免缓冲液被空气中 的氨污染；给缓冲液和茚三酮贮存瓶加压，以利于液体通过 单向阀进入泵内；吹干样品贮存螺旋管。液体的流路和色谱柱 液体流路 氨基酸自动分析仪的液体流路包括缓冲液
