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1、植物组织培养是60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程。植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。例如，组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究和实际应用，都必须借助植物细胞组织培养技术的基本程序和方法。此外，植物细胞组织培养技术也有助于我们深刻理解植物细胞
2、的全能性。实验一 母液及培养基的制备一、实验目的1了解植物外植体离体培养所需各种营养成分及激素种类。2初步掌握培养基母液配制方法。3学习掌握培养基配制方法与灭菌操作。4制备部分后续实验用的培养基。二、实验原理现在配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉，其中含有无机盐、维生素和氨基酸。把这种干粉溶解在蒸馏水里（要比培养基的最终容积少10），加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，最后再加入蒸馏水使之达到最终的容积。调节pH，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。干粉培养基可用于常规的实验目的，如植物的快速繁殖等，在这类实验中所需的培养基就可以节省时间和金钱。然而，如果在一项实验中必须对培养基中的有机或
3、无机成分做一些较大的定性和定量的改动，或者当买不到干粉培养基或嫌干粉培养基价钱太贵的时候，有两种可能的方法配制培养基。一个方法是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。但这样操作非常繁琐，而且容易出错。在配制培养基之前，为了使用方便、简化操作、用量准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，常常将配制培养基所需无机大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，置于冰箱内保存。当配制培养基时，按预先计算好的量分别吸取各种母液即可。表1.1中列举了一系列的浓缩贮备液：大量元素（浓缩20倍）；微量元素（浓缩200倍
4、）；铁盐（浓缩200倍）；除蔗糖之外的有机物质（浓缩200倍）。在制备这4种贮备液的时候，应使每种成分分别溶解，一粒不剩，然后再把它们彼此混合。各种生长调节物质制定储备液应当分别配制，如果它们是不容于水的，则应先把它们溶解在很少量的适当溶剂中，然后再加蒸馏水到最终容积。取决于所要求的生长调节物质的水平，其贮备液的浓度可以是l mmol/L，也可以是10 mmol/L。所有的贮备液都应贮存于适当的塑料瓶或玻璃瓶中，置冰箱中保存。铁盐贮备液必须贮存于琥珀色玻璃瓶中。在贮备椰子汁（液体胚乳）的时候，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于-20的低温冰箱内。作
5、为一项规则，在使用这些贮备液之前必须轻轻拨动瓶子，如果发现其中有沉淀悬浮物或微生物污染，必须立即将其淘汰。在制备贮备液和培养基的时候，应当使用蒸馏水或无离子水，以及高纯度的化学试剂。表1-1 MS培养基的贮备液成分用量（mg/L）备注贮备液（大量元素母液）20KNO338000定容于1000mL蒸馏水中。每升培养基取此液50mL。NH4NO333 000MgSO47H2O7400KH2PO43400CaCl22H2O8800贮备液（微量元素母液）200MnSO44H2O4460定容于1000mL蒸馏水中。每升培养基取此液5mL。ZnSO47H2O1720CuSO45H2O5H3BO31240N
6、a2MoO42H2O50KI166CoCl26H2O5贮备液（铁盐母液）200FeSO47H2O5560定容于1000mL蒸馏水中。每升培养基取此液5mL。Na2EDTA2H2O7460贮备液（有机母液）200甘氨酸400定容于1000mL蒸馏水中。每升培养基取此液5mL。盐酸硫胺素100盐酸比多醇100烟酸100肌醇20000三、实验用品1用具器材 电子天平（感量0.001g）、粗天平（感量0.5g）、冰箱、烧杯（1000mL、400 mL、100 mL、 50 mL）、量筒（1000 mL、100 mL、50 mL）、试剂瓶（1000mL、250mL、150mL）、药勺、玻璃棒、移液管（5
7、mL、1mL）、pH试纸（5.4-7.4）、橡皮吸球、橡皮筋、吸水纸、磁力搅拌器、高压灭菌锅等。2药品试剂蒸馏水、1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、95%酒精、蔗糖、琼脂、各种培养基母液、各种所需化学药品（分析纯）。四、实验操作步骤（一）母液的配制母液配制方法以MS培养基为例。 1无机大量元素母液的配制按培养基配方的需要量，用天平称取，并分别用100mL蒸馏水溶解，如溶解速度慢，可稍加热。在1000mL烧杯中，按表1-1顺序依次慢慢混合已溶化合物溶液并搅拌，以免产生沉淀，定容至1000mL，倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱待用。 2无机微量元素母液配制按培养基配方需要量，用电
8、子天平称取，并分别用100mL蒸馏水溶解，在1000mL烧杯中将上述溶液依次混合，定容至1000mL，倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱待用。 3铁盐母液配制按培养基配方需要量，用电子天平称取，分别在50mL烧杯中溶解后，再在1000mL烧杯中混合，定容至1000mL，倒入棕色试剂瓶（因铁盐不稳定，易分解）中，贴上标签，置于冰箱中保存。 4有机母液母液配制按培养基配方需要量，用电子天平称取，分别用50mL烧杯20mL蒸馏水溶解，在1000mL烧杯中依次混合，把pH调到5.5，定容至1000mL，倒入试剂瓶中，贴上标签，置于冰箱冷藏备用。5激素母液配制各类激素用量较小，为了方便和准确，也配制成母
9、液。母液浓度可依需要和习惯灵活确定。但注意各激素均不能直接用蒸馏水溶解，而用各种不同溶剂先溶解后再用蒸馏水定容。例如2.4-D母液配制：称取40mg 2.4-D, 用少量95%酒精或1N NaoH溶解后，再用蒸馏水定容至200mL，此时，该激素母液浓度为1mg/5mL。一般地，NAA、IAA、IBA等生长素是醇溶性的，均可用少量95%酒精先溶后再蒸馏水定容，而KT、6BA、ZT等细胞分裂素可先用少量1N HCl或1N NaOH溶解后再用蒸馏水定容。冰箱保存。上述各种母液冰箱保存均不宜时间过长，储藏中如发现母液中出现沉淀或霉团时，应弃之。（二）培养基的配制以MS 1L培养基为例。（1）称琼脂10
10、g（琼脂浓度0.8-1）溶于2/3或一半以上所需培养基体积即700mL左右的蒸馏水中，加热煮融。另称取蔗糖30g（糖浓度3%），待琼脂完全煮融断电后趁热加入，并搅拌使之溶解。（在配制液体培养基时则无须加热，因为蔗糖甚至在微温的水中也能溶解。）煮琼脂的同时，可用量筒或移液管依次量取各种母液混合于一烧杯中：无机大量母液50mL，无机微量、有机物、铁盐母液各5mL，激素母液种类及取量依不同培养基配方临时确定，如果由于特殊原因有必要在高压灭菌之后再加入维生素和生长素，那么在调节了pH值之后，可使这些物质的溶液通过孔径为0.220.45m的微孔滤器消毒。（2）将上述液体混合，并用蒸馏水定容为1000mL
11、。用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调pH值至5.8，调时应不断用玻璃棒搅动，并用 pH试纸测试。（3）趁热将培养基分装于约30个三角瓶（50mL）中，每瓶约20mL，每个25150mm的试管约装培养基15mL。分装时应避免把培养基倒在瓶口上，否则易引起杂菌污染。如果在步骤（1）（3）期间培养基开始凝固，应将装培养基的三角瓶置水浴中加热，只有当培养基为均匀的液态时才能分装；（4）用包在纱布中的棉塞（它能阻止微生物污染，但可使气体自由交换），或其他适宜的塞或盖封严瓶口，做好标记；（5）把已装入了培养基的培养容器装在铁丝篮里，外面包上一层铝箔以防止棉塞在高压灭菌时吸湿，在 120（
12、l.06kg/cm2）下灭菌 15min；如果所用的是已经灭过菌的不耐高温的塑料培养容器，培养基可装在250或500mL的三角瓶中，以铝箔或牛皮纸封住瓶口，进行高压灭菌（有的实验室也使用1 000mL三角瓶，只是大三角瓶在分装时不太方便）。灭菌后使培养基冷却到大约60，然后在无菌条件下将其分装到容器中；（6）使培养基在室温冷却，在培养室中放置一周。当用试管制备琼脂固化培养基时，最好把培养基做成斜面，这只要在冷却期间将试管斜置即可。斜面培养基可为组织的生长提供一个较大的表面积，同时，拍照长在斜面上的培养物也比较容易。Street（1977）说过，“在实验中由培养基制备上的错误所造成的问题比由任何
13、其他技术过失所造成的要多”。为了尽量减少人为的误差，必须严格按上列各个步骤进行操作。应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。所有的装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记，这样即使经过高压灭菌和长期贮藏之后也不难识别它们。五、思考题1分析配制培养基的各种母液的原理及其注意事项，并作说明。实验二 无菌操作及愈伤组织的诱导一、实验目的1了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求。2初步掌握植物外植体材料灭菌方法及接种操作技术。3了解外植体愈伤组织诱导过程。二、实验原理（一）无菌操作1玻璃器皿及金属器械的消毒（1）玻璃器皿（培养容器）：常常与培养基一起灭菌，如
14、若培养基已先灭菌，而只需单独进行容器灭菌时，通常有两种方法。一种是干热灭菌法，即在鼓风干燥箱内，于160180条件下连续处理3h，冷却备用。一种是湿热灭菌法，即利用高压蒸汽灭菌锅来进行灭菌处理，用时烘干处理即可。实验室中通常采用后一种方法。（2）金属器械的消毒：如实验中经常用到的镊子、解剖刀、解剖针等，一般是在95%的乙醇溶液中浸蘸一下，然后于酒精灯火焰上烧灼，冷却即可使用，但要记住每次操作前后都要进行同样的处理。2材料的灭菌在接种前，必须使材料完全灭菌，这是取得植物组织培养成功的根本保证。为保证这一点，则需做到以下两点：（1）要选取植物组织内部无菌的材料为什么这么说呢？因为当植物体（即我们今
15、天所要用到的外植体）有伤口或病虫时，在组织的内部就会有细菌、微生物等，因此要选取没有伤口、病虫的健壮的外植体。另一方面，应该在晴天，最好是中午或下午时取材，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材，因为这时植物表面的微生物易于滋生且不易清除，而晴天时，植物呼吸作用旺盛，并且自身有消毒作用。所以这时的材料内源细菌污染小一些。（2）完全杀死材料表面带有的各种微生物表面消毒的基本要求是既要杀死材料表面的全部微生物，又要不伤害材料本身。因此要根据不同材料选用适当的消毒剂，合适的浓度和处理时间，灵活运用。（3）常用消毒剂的种类漂白粉：常用的低毒有效消毒剂，使用的浓度一般为510%或其饱和溶液，取用上清液，处理材料1030 min，杀菌效果好，且不易伤害组织。其主要成分是次氯酸钙，易吸潮而失效。因此要密封保存，用时随配随用。乙醇：7075%的乙醇具有较强的浸透力和杀菌力，生长组织只需浸1030s。常用作表面灭菌的第一步，因不能彻底消毒，往往还需使用其他消毒剂。次氯酸钠：也就是市售安替福民，通常配成210%
