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1、报告基因载体报告基因载体的特点：除了具有表达蛋白质所需要的结构外，理想的报告基因载体 本身无调节结合位点或序列，而具有有意插入的调节结合位点，尽管可以从报告基因载体除 去已知的结合位点，减少报告基因上游的转录，但从几千kb的DNA中去除所有潜在的调控 序列是不可能的。因此在使用报告基因载体时，应使用合适的对照载体。报告基因质粒载体 一般在大肠杆菌中繁殖，因此包括一个DNA复制起始点(ori)和基因筛选标记，通常为氨苄西 林抗性基因(Ampr)。另外还具有丝状噬菌体复制起始点(flori)，可使载体形成单链DNA，便 于基因突变和测序。(2)报告基因和侧翼区：报告基因编码区和侧翼区常被改变。例如
2、，去除SEAP(分泌型 碱性磷酸酶)羧基末端24个氨基酸，使SEAP能直接分泌到细胞外，因此测定SEAP活性不 必裂解细胞。去除荧光素酶的过氧化物酶体靶向序列，使荧光素酶转运到细胞质而非过氧化 物酶体中。为了使报告基因表达最大化，核糖体最佳结合序列GCCGCCCCATG)被置于报告基 因的5端。此序列能增加翻译效率，产生NcoI酶切位点，可使外源基因N末端与报告基 因融合。多克隆位点：许多报告基因含有2个以上克隆位点(MCS)，一个位于报告基因上游， 用于插入假定的克隆启动子或增强子/启动子区；另一个位于其他位置，用于插入克隆调控 元件，例如插入可远距离发挥作用的增强子。另外，还有用于插入基因
3、筛选标记的克隆位点， 用于筛选稳定表达报告基因的宿主细胞。MGS具有几个单酶切位点，用限制性内切酶催化 可产生黏性末端。DNA片段可插到此位点。MCS还包括一个或两个MCS末端，此末端序列 可由限制性内切酶催化断裂形成3悬垂末端，可用核酸外切酶III进行嵌套缺失分析。多聚腺苷酸信号:多聚腺昔酸(polyA)可增强哺乳细胞mRNA稳定性和mRNA的翻译。 polyA序列紧随报告基因之后，可指导RNA转录物3端添加200250个腺昔酸残基。在 转录单位5端插入polyA信号能降低源于载体的隐匿启动子序列基因表达水平，去除背景 表达，增加报告基因系统的灵敏性。在报告基因转录单位上游3个阅读框中均插入
4、终止密码 子，可进一步降低源于载体的假转录背景。常见的报告基因报告基因必须具备的特点：由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内 任何相似的产物相区别；细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；报告基因 编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，先让质 粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。与此同时，还要将 有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒共转染同一细胞，作为转染率的内对照。(1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)该报告基因来源于大肠杆菌转位子9,是第1个用于检测细胞内转录活性的
5、报告基因。 氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT 在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光 素和酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbantassay， ELISA)检测其活性，也可进行 蛋白质印迹(Westernblotting和免疫组织化学分析CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄， 灵敏性较低。(2) 8半乳糖苷酶：p半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最 大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。 以邻一硝基苯一p
6、D一半乳毗喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测 动力学范围为6个数量级。氯酚红一p 一D一半乳毗喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测 酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则 可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。 如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最 高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。(3) 荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧 光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光
7、素酶和Renilla荧光素酶。细菌荧 光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性 范围宽达78个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即可检测酶活性， 因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂 解细胞即可检测酶活性。Renilla荧光素酶催化肠腔素(coelenterazine)氧化，产物可透过生物 膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光 素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。自1986年起，萤火虫荧光素酶基因被 用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应
8、用Promega公司的pGL3及pGL2系列载体， 含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。荧光素酶报告基因有许多优点：非放射性；比CAT及其他报告基因速度快；比 CAT灵敏100倍；荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3. 5 小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积 累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在1016mol / L(10pS / L) 到10-8mol / L(1mg / L)范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到 l0-20mol / L的荧光素
9、酶。Promega公司的荧光素酶检测系统比一般的方法灵敏及简单，产 生的光稳定。(4) 分泌型碱性磷酸酶(SEAP)： SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP 缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可 检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的比色法 测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌吟二核苷酸磷酸 为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D一荧光素一O一磷酸盐水解生成D一荧 光素，后者又可作为荧光素酶的底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏
10、度高，接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学发光法检测酶活性。(5)荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量 为20 00030 000的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发 光水母(AequoreaVictoria)中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508nm处 自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内 事件。1991年克隆了 GFP基因，目前已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体(red shiftmutant)，其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型GFP(EGFP)和去稳定 EGFP(destabilizedEGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(Discosoma sp.)中分离的发光蛋白(drFP583或DsRed),可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检 测2个甚至3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。 稳定性好的报告基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研 究。
