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1、第六节结核分枝杆菌实验活动风险评估报告一、生物因子(一) 一般特性结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis )，于1882年由德国微生物学家Koch发现 并证实为结核病的病原菌。1886年，Lehman和Neuman正式将其命名为结核分枝杆菌，又称 结核菌。1. 形态与染色结核分枝杆菌细长略弯曲，端极钝圆，大小约(14)mX(0.30.6)um，呈单个或分 枝状排列，有时呈V、Y、人字型排列，无鞭毛和芽孢。多数学者认为结核分枝杆菌无荚膜。 结核分枝杆菌常用萋-尼氏(Ziehl-Neelsen)抗酸性染色法染色，染色后结核分枝杆菌呈现 红色，其他非抗酸性细菌呈蓝色。结核
2、分枝杆菌除正常典型杆状形态外，在陈旧的病灶和培 养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等；或受物理因素、化学因 素，以及药物等因素的影响，而呈现异常变化；另外，还有可通过在内在电镜下观察细菌滤 膜的滤过型、细胞壁缺损或丧失的细胞壁缺陷L型，以及存在于结核病灶、浆液性渗出液等 样品可看到的革兰染色阳性颗粒的球状微粒型。2. 生长特性和培养结核分枝杆菌为缓慢生长细菌，较普通细菌生长十分缓慢，在动物体内繁殖代时约为 15h，在家兔角膜中约需要2022h，在巨噬细胞内月需要1520h。体外生长时营养要求高， 可在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素或动物血清等的固体培养基上生长。最适PH
3、6.4 7.0，在3540C可生长，最适温度为3537C。常用的培养基有罗氏培养基、小川培养基、 油酸血清(白蛋白)琼脂培养基和苏通液体培养基等，在良好的培养条件下，生长代时约 1824h，培养24周才出现肉眼可见的菌落。在固体培养基上菌落呈颗粒、结节或花菜状， 乳白色或米黄色，不透明；而在液体苏通培养基内呈粗糙皱纹状菌膜生长。3. 生化反应结核分枝杆菌能够产生硝酸盐还原酶，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐；在酸性条件下， 亚硝酸盐与氨基苯磺胺、N-甲萘基乙烯二铵盐酸盐形成红色偶氮化合物。牛分枝杆菌和部分 非结核性分枝杆菌不能产生硝酸盐还原酶，因此可用于结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别。 结核分枝杆菌缺
4、乏烟酸酶，故不能分解代谢过程中产生的烟酸，在培养中，结核分枝杆菌生 长时的烟酸聚集量较牛分枝杆菌及其他分枝杆菌高。烟酸砒啶环的氮与联苯胺及漠化氰作用 后，呈现桃红色或红色沉淀反应。通过烟酸试验可以将结核分枝杆菌同其他分枝杆菌区分。4. 免疫学特性抗结核免疫反应在结核分枝杆菌感染中起着根本作用，免疫系统能有效地抵抗大多数 感染，感染结核分枝杆菌的大多数人(约90%)在其一生中并不能发展成患有结核病。然而， 当与免疫系统疾病同时存在时，如合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV),发展为结核病的机会 就会大大增加。结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。当结核分枝杆 菌侵入人体内，被
5、巨噬细胞吞噬后，未活化的巨噬细胞的抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结 核分枝杆菌生长，但可递呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏。致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因 子，如IL-2、IL-6、INF-Y。这些因子与TNF-a的共同作用可杀死结核分枝杆菌。结核分枝杆菌的免疫属于感染免疫，又称有菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分 存在体内时才有免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其组分全部消失，则免疫也随之不存在。5. 遗传特性结核分枝杆菌基因序列有4400多万bp，包含了 4000多个基因，有很高的鸟嘌吟（G） 和胞嘧啶（C）含量。结核分枝杆菌基因组在进化过程中形成了不同的分枝，主要有北京家 族、东非-印度分枝、中
6、亚或德里家族、哈勒姆家族、拉丁美洲和地中海家族等，其中北京 家族有高毒力和高致病性。6. 耐药性结核分枝杆菌产生耐性的机制主要是靶编码基因的突变所致。结核分枝杆菌的自然耐药 突变率为10-1010-5之间。当结核分枝杆菌的编码基因发生突变后，其对耐药的敏感性表型 发生改变，这样的突变是随机、自发的，并和是否与药物接触无关。在一个菌群中，耐药个 体的出现是以一定频率产生的，并随着药物对敏感菌体杀灭的选择作用，耐药菌体的比例逐 渐增加，直至成为耐药菌优势菌群。耐药结核分枝杆菌可以分为原发耐药、初始耐药和继发 耐药，但结核分枝杆菌会出现交叉耐药的情况，即对一种药物产生耐药后，同时又对另一个 药物也产
7、生敏感性的改变。（二）来源结核杆菌可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病是一种古老的疾病，也许有 了人类之后，不久就有了它的存在。1965年，法国学者Sylvius根据解剖了死于所谓“消 耗病”或“痨病”人的尸体，发现肺脏及其他器官有颗粒状的病变，根据其形态特征称之为 “结核”。1973年，湖南长沙马王堆汉墓出土的2100年前的女尸身上发现左上肺门均有结 核病灶。因而，结核的名称就此被应用至今。（三）传染性因结核病病变进展的患者痰中带有大量的结核杆菌，故这类患者是结核病的主要传染源， 痰中的结核杆菌越多，传播的危险性就越大。病人出现痰涂片阳性，若1mL痰液中含菌量为 100010000，
8、则其痰涂片阳性率为40%50%。病人排菌量越大，其密切接触者的感染率也 就越高。结核杆菌菌株之间毒力有较大差异，不同类型的病人排出结核杆菌不仅在数量上不 同，其毒力也不同，因而其传染性亦不同。感染的结核杆菌活力越强，数量越大，传染性也 越强。感染药物敏感菌的结核病患者在未治疗时的相对传染性为100%。通常，结核病患者经一 段时间治疗后，结核杆菌对人的感染能力减弱，相对传染性降为25%；感染耐药菌的病人未 治疗时相对传染性为100%，在治疗时则降为27.3%。（四）传播途径结核分枝菌主要通过呼吸道传播，传染源主要是排菌的肺结核病人（尤其是痰涂片阳性， 未经治疗者）的痰。飞沫感染为最常见的方式，健
9、康人吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的飞沫 而受感染。直径小于10um的痰滴可进入肺泡腔，或因其重量轻而漂浮于空气中较长时间， 在室内通风不良环境中的带菌飞沫，亦可被吸入引起感染。感染的次要途径是经消化道进入 体内。少量、毒力弱的结核分枝杆菌多能被人体免疫防御机制所杀灭。仅当受大量毒力强的 结核菌侵袭而机体免疫力不足时，感染后可能发病。其他感染途径，如经皮肤、消化道、泌 尿生殖系统等均少见。（五）易感性1. 宿主范围 结核分枝杆菌的宿主包括人、牛、犬、猪、猴、羊等。人、畜、禽类被结核杆 菌感染后，在感染个体的机体多种组织内形成肉芽肿和干酪样钙化灶为特征的慢性传染病。2. 易感人群结核病主要是人群之间
10、传播的传染病，发生结核杆菌传播主要取决于传染源排 菌情况。在受到结核菌感染的人群中只有4%5%的人发生结核病，其余90%以上的人并不发 病。3. 易感者的自身因素结核杆菌进入人体，引起易感者机体的复杂反应。易感者的身体和心 理等状况均可影响机体的反应过程和结果。机体的自然免疫力强、接种过卡介苗（Bacillus calmette guerin,BCG）或受过感染后获得了免疫力，则能将入侵的结核杆菌杀死或严密包 围，制止其扩散，使病灶愈合。（六）潜伏期潜伏期尚不明确，可能为数天、数月、数年。（七）剂量一效应关系传染源排出的飞沫受压力和黏度的影响而大小不一。飞沫核直径为110um者在空气中 漂浮的
11、时间长。进入人体末梢气管内越多，越容易传播。豚鼠通过气溶胶途径接触15个 结核分枝杆菌感染就可造成肺部感染并导致死亡。小鼠对结核分枝杆菌少见天然感染，静脉 注射标准毒株H3Rv2501000万个菌量，可于半月左右发病死亡。而杂种小鼠则需要更大的 剂量。不同小鼠株系也有耐受和敏感性程度上的差异。（八）致病性结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎 症、菌体成分和代谢物质的毒性，以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结 核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为多见。因肠道中有大量正常菌群寄居，结
12、核分枝杆菌 必须通过竞争才能生存并和易感细胞黏附。肺泡中无正常菌群，结核分枝杆菌可通过飞沫微 滴或含菌尘埃的方式被吸入，故肺结核较为多见。1. 肺部感染 由于感染菌的毒力、数量、机体的免疫状态不同，肺结核可以有以下两类表 现。（1）原发感染：多发生于儿童。肺泡中有大量巨噬细胞，少数活的结核分枝杆菌进入肺 泡即被巨噬细胞吞噬。该菌有大量脂质，可抵抗溶菌酶而继续繁殖，使巨噬细胞遭 受破坏，释放出的大量菌在肺泡内引起炎症，称为原发灶。（2）原发后感染：病灶亦以肺部为多见。病菌可以是外来的（外源性感染）或原来潜伏 在病灶内（内源性感染）。由于机体已有特异性细胞免疫，因此，原发后感染的特 点是病灶多局限
13、。一般不累及邻近的淋巴结，被纤维素包围的干酪样坏死灶可钙化 而痊愈。若干酪样结节破溃，排入邻近支气管，则可形成空洞并释放大量结核分枝 杆菌至痰中。2. 肺外感染 部分患者体内的结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内、外播散，如脑、 肾结核，痰菌被咽入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。结核分枝杆菌缺乏明确的外毒素、侵袭性酶和内毒素。其毒力与素状因子、硫脂、脂阿 拉伯甘露聚糖、磷脂、某些分泌性蛋白等有关。但在整体水平和细胞水平仍未得到可满意的 解释病原性毒力因子。其致病性可能与在宿主体内顽强增殖和引起机体的病理性免疫反应有 关。结核感染和发病时间之间存在着很大的个体差异，感染后数月至数十年发病，甚
14、至可终身无 病。欧美在20世纪报道一代感染者中约有5%10%发病。日本在20世纪3040年代统计 表明年内发病率为30%，近年报告降低为10%。我国无确切统计数字可依据。在发病者中近 半数在感染后半年至两年内于机体抵抗力低时发病。90%的结核菌感染者可保持终生不发病。（九）变异性结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗BCG）就是 Calmette和Guerin 2人（1908年）将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中 经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株。结核分枝杆菌的耐药性变异随着化疗药物的应 用而产生，耐药利福平药物结核分枝杆菌多联系ropB基因突
15、变，而异烟肼、毗嗪酰胺多联 系katG和inhA、pncA基因的突变。一株结核分枝杆菌可以发生多到对十几种药物的耐药， 印度等国家就陆续报道了全耐药结核分枝杆菌（TDR-TB）。（十）稳定性1. 在自然环境中的稳定性与对温度的敏感性 在自然条件下结核分枝杆菌在室内阴暗潮湿 处能存活半年；在干燥的痰中于阴暗处可存活68个月；在随尘土飞扬的空气中可保持传 染性810d；在污染的图书上可存活3个月；3C条件下存活1年，一68C环境下可存活 45年。另有资料表明，室内的结核分枝杆菌微滴核约60%71%，可存活3h，48%56%中 存活6h,28%32%中存活9h以上。2. 化学灭活 结核分枝杆菌直接接
16、触70%75%乙醇530min可被杀死，因此可用于皮肤消 毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一层把菌体包裹起来的膜，短时间内不能杀死细 菌，通常乙醇不用于痰标本的消毒，1%甲醛处理结核分枝杆菌5min，可使细菌死亡。5%甲 醛和痰液等量混合，处理12h以上才能达到杀菌作用。在房间密闭性好、相对湿度60%80% 的条件下，使用810g/m3甲醛熏蒸12h以上，可有效杀灭空气中和光滑表面物品上的结核 分枝杆菌。对结核分枝杆菌污染的室内空气，可用甲醛气体熏蒸的方法进行终末消毒。3. 物理灭活 干热180C可达到杀菌目的，杀死痰中的结核菌则需3h以上。结核分枝杆菌 对湿热敏感，65C 30min或95C 1min可杀灭结核分枝杆菌纯培养物；100C煮沸5min可 杀死痰中结核分枝杆菌。65r巴氏消毒法可用于牛奶中结核分枝
