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1、转基因小鼠的鉴定一、 剪鼠尾1. 剪鼠尾的时间 当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠 尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。2. 分辨小鼠的年龄a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生; b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生23天； c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生34天；d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右；e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右；f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。3. 剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法二、从鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DN
2、A，操作如 下：1. 剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180吐 Buffer GTT。震荡混匀。2. 加入20吐proteinase K,涡旋震荡，彻底混匀。3. 置于56C水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋 震荡，使样品均匀分离。1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20卩1 proteinase K消化，不会影响后续操作。2） 如需去除RNA,可在上述步骤完成后，加入4卩1浓度为lOOmg/pl的 RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。4.14000rpm离心1 min，以消除未消化的类似于
3、鼠毛等组织，将上清转移到一 个新的灭过菌的离心管中。5.加入200pl Buffer GL,涡旋震荡，充分混匀，加入200pl无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。1）加入 Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。2）如果多个样品一起操作，Buffer GL和无水乙醇可以等比例混匀后一起 加入样品。3）加入 Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。6. 将步骤 5 中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能 加完溶液，可分多次转入。lOOOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。
4、7. 向吸附柱中加入500卩1 Buffer GW1 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。8. 向吸附柱中加入500卩1 Buffer GW2 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需 进一步提高 DNA 纯度，可重复步骤 8。9.12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以 彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续 的酶促反应（酶切， PCR 等）。10.将吸附柱置于一个新的灭过
5、菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-2001 Buffer GE 或灭菌水，室温放置 2-5min， 10000rpm 离心 1min，收 集DNA溶液，-20C保存DNA。1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH 值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接, PH值低于7.0时洗脱效率不高。2）离心前室温孵育5min可增加产量。3）用另外的50-2OOyL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。4）如果需要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新 加至吸附膜上，重复步骤10;若洗脱体积小于200y
6、L，可以增加DNA的 终浓度，但可能会减少总产量。三、 PCRPCR 程序设定：1=94.0Cfor 5:002=94.0Cfor 1:003=59.0Cfor 0:504=72.0Cfor 1:005=Goto 22times6=94Cfor0:507=58Cfor 0:508 = 72C for 1:009 = Goto 6 2times 10= 94.0 C for 0:50 11=56.0C for 0:50 12= 72.0C for 1:0013= GotolO 32times14= 72.0C for 10:0015= 4.0 C for 5:0016 = END 目前实验室的双
7、转基因小鼠 AD 体系采用PCR反应的体系（12卩1）： APPPrimer APP-11.3 p!Primer APP-21.3 plddH2O2plmix（CW0682）6plDNA1plPCR反应的体系（12pl）： PS1Primer PS1-11.3plPrimer PS1-21.3pl内参-11pl内参-21plmix（CW0682） 6plDNA1pl先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加 两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽 量避免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样 品
8、。引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为 x nmol,使用前先用12000rpm离心1min,加入10x pl ddH2O,涡旋振动混匀， 微型离心机离心，即可得到 100pM 的母液，取 10pl 的母液，用 ddH2O 稀释 10 倍，即加入90pl，混匀后即可得到10pM的引物工作液。四、 电泳1配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种，分别用的梳子为50、25、11齿。 分别用的0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。用1.5%的琼脂糖凝胶。2. 点样：12pl的DNA，Marker加5pl。点样时注意逐个点样，不要点错， 最好把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。Marker的选 择依基因片段大小而定。3. 跑电泳：打开电源，150v电压，30min左右即可。4. 照胶：看是否有目的条带，即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子。5. 保存。
