酶标记抗体

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1、酶标记抗体酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记 SPA 等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术 的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当 方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制 备方法。目前，高质量的酶（如辣根过氧化物酶，简称HRP）国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提 取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行 的方法。（一）酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列

2、要 求：（1）来源方便，易于纯化；（2）比活性高，性质稳定；（3）酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶 技术中常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和硷性磷酸酶（AP），其次还有葡萄糖氧化酶，作半乳糖苷酶、溶 菌酶和苹果酸脱氢酶等。由于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所 以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋 白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH39,酶催化的最适PH因供氢 体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和

3、58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最 大吸收光谱分别为403nm和275nm，般以OD403nm / OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示 酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）o RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是， 纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。HRP的催化反应需要底物过氧化氢（H2O2）和供氢体（DHJ。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应 可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反应的过程如下：HRPDH2+H2O2D+2H2O供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB（3.3-二氨基联苯胺）的反应产物

4、为不溶性沉淀物， 并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS（5-氨基水杨酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不 够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT（邻联甲苯胺）的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵 敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛 和较满意的供氢体是：OPD（邻苯二胺）和TMB（四甲基联苯胺）。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者 产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可 高 4 倍以上。另外，还有一种供氢体称 ABTS2, 2-边氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯

5、啉-6 磺酸），其反应产物 呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较 短时间反应后呈色即达高峰(说明H2O2已消耗殆尽)。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜 色。(二) HRP 标记抗体的方法酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊 二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。筐戊二醛二步法1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成

6、酶- 戊二醛-免疫球蛋白结合物。2. 标记步骤：(1) 称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2) 反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在 1ml1 分钟，收集棕 色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4C1小时。(7) 3000r

7、pm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH 7.4 的 PBS 中。(8) 将上述溶液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检 测)， 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。3. 结果判定：(1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验 或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接 ELISA 法(或在正式实 验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。(

8、2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程 1cm)。酶量(mg / ml) = OD403nmX0.4IgG 量(mg / ml) = OD280nm-OD403nmX0.42)X0.94X0.62酶量(mg / ml)IgG 量(mg / ml) 酶量克分子比值=F=X 440,000160,000 IgG 量(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有24%的酶与蛋白质结合。4. 试剂及器材：(1) 0.1M PH6.8 磷酸缓冲盐水(PBS)：取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml, NaCI1.8 克, 加蒸馏水

9、至 200ml。(2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。(5) 0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。(6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG, MW2000)。(8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。(9) HRP(RZ3.0)。(10) Sephadex G-25 层析柱(2cm X 50cm)。(11) 搅拌器，分光光度计，

10、离心机。(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。简易过碘酸钠法本法是以NalO 4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体 的产率高，将近70%的HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用 的方法。1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的a-和氨基基以避免酶分子之间 的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NalO氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HR4P 经 NaIO 氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用 NaBH (或乙44 醇胺)还原生成稳定

11、的酶标记抗体。2.标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO 4溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4C过夜。(4)加20pl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH 4液，混匀，再置4C2小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4C过夜。其余

12、步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。3. 结果判定：除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG 量(mg / ml) = (0D280nm-0D403nmX0.3)X0.624. 试剂及器材: 0.1M NalO 4：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。(2) 1mM PH4.4 醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.361 克/ 50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml50ml) 6.3ml加蒸馏水至 2,000ml。(3) 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液:Na 2 CO 3 0.32 克

13、NaHCO3 0.586 克加蒸馏水至 50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4) NaBH 4 溶液(4mg / ml):临用时称取 NaBH4 4mg 溶于 1ml 蒸馏水中。(5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。(三) 工作浓度的选择在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化， 便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响 测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列

14、稀释的酶标抗 体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的 效价，或称工作浓度。其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10pg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内 加0.1ml, 4C过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1 ： 100, 1 ： 200, 1 : 400, 1 : 800, 1 : 1600(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每 孔0.1ml, 37C孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml, 37C1030分钟。以2M H SO 0.

15、0524 ml 终止反应。结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定 曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这 就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度（可采用方阵法），以达到最适 的实验条件。（四）注意事项1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高（最低1 ： 16），纯度高，亲和力好， 这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。2. 所使用试剂的 PH 和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好（或必需）新鲜配制。如在戊二醛标 记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质）。否则，影响标记效果。3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25C为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。4. 浓的标记物相当稳定，常加入3040%甘油于-10C下保存。4C可保存12年，但稀释成1 ： 1 0，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。