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1、ELSEVIERBIORESOURCETECHNOLOGYapplied microbiology bioconversion/biocatalysis biofuels biological engineer!ng biological waste treatment biomass 公证手稿 与氯化铵浸渍相关的新型预处理方式陈鸿章，李冠华，李洪强PII ： S0960 - 8524 （ 13 ） 01741-0DOI ： http:/dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2013.11.025 参考： BITE 12645出现在：生物资源技术收稿日期： 2013 年
2、9 月 10 日修订日期： 2013年11月4 日接受日期： 2013年11月10 日引用此文章为：陈，H.,李，G.,李，H.,与氯化铵浸渍相关的新型预处理方式，生物资源技术（ 2013 年） ， DOI ： http:/dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2013.11.025这是一个已经被接受发表的 PDF 文件原始稿件。作为手稿的早期版本。这份手稿是进行审 稿，排版，以及回顾之前发布其最终形式的证明。请注意，在发表过程中可能会产生些许错 误，这可能会影响其内容，所有的法律免责条款适用于有关杂志。与氯化铵浸渍相关的新型预处理方式陈鸿章，李冠华，李洪强 生化工程国家
3、重点实验室，过程工程研究所，中国科学院，中国，北京，邮编100190摘要提高氮含量和酶水解是涉及到纤维素乙醇生产的关键工序，用NH4C1预浸后进行蒸汽爆炸 (SE )并对其试验后的氮含量，酶消化性和乙醇产量影响进行研究。结果表明，预处理后 样本中氮含量会增加，这可以作为乙醇发酵的氮源。通过90 g/l NH4CI预浸渍并以1.4 MPa SE的样本最高葡萄糖产量为62.64%，相比于未处理样品和只通过1.4兆帕SE处理的样本 分别高出2.1和0.2倍的效果。相比于未处理样品和只通过1.1 MPa SE处理的样本，通过 135 g/l NH4Cl预浸渍并以1.1 MPa SE的样本乙醇产量分别高
4、出1.93和0.69倍的效果。这 种新型预处理方式相较于常态下的处理极大的提高了氮含量和酶消化性，建议进一步的运用 于工业化生产。关键词：蒸汽爆炸，氯化铵预浸渍，酶解，生物量，乙醇。*通讯作者.电话：+86 10 82627071 ，传真： +86 10 82627064电子邮件地址： ( H.Z.陈) 简称：SE,蒸汽爆炸;SERS，稻草汽爆;URS，未经处理的稻草。1.简介 全球气候变暖和化石燃料的枯竭导致了能够减少对化石燃料储量依赖的可替代、可再生能源 越来越受到人们的关注 (Moriarty & Honnery, 2012). 由于木质纤维素的大量存在，生物乙醇 产品成为最有前途的生物
5、燃料，这吸引了来自于政府和私人组织的大量关注 (Sarkar et al., 2012). 广泛的研究和试验工厂的试生产为木质纤维素生产乙醇的进一步调研和优化奠定了 基础 (Chen & Li, 2013) . 一般来说，木质纤维素转化为乙醇包含两个步骤：经水解将多糖转 化成单糖和通过发酵将单糖转化成乙醇(Limayem & Rieke, 2012).天然木质纤维素因其具有 高度的抗水解结构导致不能自然进行酶水解。(Jeoh et al., 2007).但人们已作出努力通过各种 预处理来破坏复杂的抗水解结构，而酿酒酵母的培养和发酵显然已能够达到相应氮水平 (Casey & Ingledew,
6、1986).然而，稻秆公认属于营养缺乏型(Lau et al.,2008.).因此，额外的营 养补充被视为不可避免的。酵母粉，蛋白胨，铵盐和尿素总是被应用于工业原料。虽然有机 氮源中富含的肽和游离氨基酸，但成本太高。铵常常代替有机氮源，但营养很差。蒸汽爆炸(SE)是最有效的预处理方法之一，由于只需要较低的化学品使用量和能源消耗 已被应用于工业化大生产(Chen & Liu, 2007),蒸汽爆破可以结合物理撕裂或化学降解对材 料进行影响。在快速减压过程中饱和蒸汽能穿透秸秆的毛孔并撕裂大量的气孔，而材料在化 学高温状态下会使其半纤维素和木质素得到降解。由此, 我们可以得出的结论是铵盐可以通 过物
7、理或是化学方式参与到材料的预处理过程中来。因此，建议在蒸汽爆炸前进行氯化铵的 预浸。众所周知氯化铵是强酸弱碱盐，其溶液的pH值是弱酸性。以前的研究已经表明，在 酸性条件下我们可以通过高温来提高半纤维素的解聚(Martin et al., 2002.).相较于SO2和 h2so4, nh4cl的腐蚀性和刺激性较小。更重要的是，在木质纤维素材料中掺入铵盐，在高 温下其中的一些糖醛酸与木聚糖会因酯交联而发生氨解反应 (Wang et al., 1967; Barton et al., 1986).通过比较加入氯化铵预浸渍后蒸汽爆炸的结果，可知氯化铵预浸渍能增强预处理效 果，这是可能是因为铵可以转化为
8、其它类型的氮源存在，这有利于乙醇发酵。 据我们所知，很少有研究将蒸汽爆炸和氮添加工艺结合起来，所以首先我们需要评估蒸汽爆 炸和氯化铵预浸渍结合起来的潜力。需要对预处理后氮含量、半纤维素、纤维素和木质素的 成分变化进行测定。同时还需要根据预处理后酶水解和乙醇产量的效果对预处理的有效性进 行评价。2 材料及其方法2.1 原材料由中国四川省成都的农村地区收集到的水稻秸秆(Oryza sativa)。每份稻草由手工切制成15 厘米大小，用湿布清洁上面灰尘，然后常温下风干。选择的纤维素酶是里氏木霉YG3,平均 滤纸酶活可达到50-60 FPU/ml。在研究中所用分析纯度试剂均购买来自于中国北京化学试剂
9、公司。2.2 氯化铵预浸渍处理的蒸气爆炸实验将干稻草用以1:1比例的水或氯化铵溶液(90克/升和135克/升)浸渍，并保证在室温下静置 一夜。然后将预浸渍的稻草放入4.5升自主研制的蒸汽爆炸容器中(威海自动化有限公司， 威海，中国)。在1.1或1.4 MPa下进行4分钟的蒸汽爆炸，卸压后可得到汽爆稻草(SERS)。 另一组对照实验为干稻草预浸渍处理(以1:1的比率)，并保证在室温下静置一夜，不进行蒸 汽爆炸，将其作为未处理稻草(URS)。2.3 初步水解、同步糖化以及发酵URS和SERS直接用于同步糖化发酵试验而不进行清洗。URS和SERS的初步水解发生在以醋 酸钠为缓冲液(lOOmM, pH
10、值4.8),装载20 FPU/ g纤维素酶作为底物的水浴摇床上，在50C 下缓慢搅拌36小时。初步水解后，待到温度降低至137 C。根据NH4C1 (9 G/100 g底物)的相 对含量用URS和SERS (未预浸渍的气爆稻草)进行填充再进行发酵实验。在厌氧条件下用 装载有10% (v/v)酵母(酿酒酵母)接种溶液密封发酵36小时。酵母接种物的制备，将1克干 酵母加入到50毫升含20克/升葡萄糖的无菌水中，让其在37C下反应1小时。为了检测不同预 处理方式的差异性，用SPSS对结果进行单因素方差分析。所有的结果的差异性很显著的表 示在 PW0.05 with number of replica
11、tes of 2。2.4 分析方法2.4.1 化学成分分析使用由Sluiter等人的标准NREL方法测定URS和SERS的化学组合物(Sluiter et al., 2008)。 在30C下将样品在72%H2SO4溶液中用水浴法处理60分钟，然后通过加入蒸馏水将酸溶 液稀释到4%,在121C下高压灭菌1小时。过滤分离出残留物和水后将残留物在105C下 晾干一晚。然后将干燥的残留物在550C下加热3小时，并确定灰分含量。通过加热前后残 留物灰分含量之差可计算出酸性不溶木质素的含量。水解后滤液的主要结构组分(葡聚糖、 木聚糖和半乳聚糖)可在65C下用5mM的H2SO4配以0.5毫升/分钟作为流动周
12、期(Zhang et al., 2013)通过配备了折光率检测器(G1362A)和Aminex HPX-87H的HPLC高效液相层析 仪(HPLC; Agilent 1200, American)得出。样品中酸性可溶木质素是由紫外分光光度计测定。 单糖的初步水解和乙醇的同步糖化发酵后的上清液浓度同样是通过HPLC分析得出。纤维素转化率计算如下：_ amount oPglucose 地-i；amtuni nPGcJIntiiosc (g； i； 9Cdulose convcion广；IOCam tutrit of cd I u lose (1) 0.9和0.95分别是葡聚糖和纤维二糖转化为葡萄糖
13、的换算系数。乙醇产率计算如下：Ethanol yield (%)=EtOH/0.511x(fbiomassx1.11)x100(2) EtOHt是乙醇的重量，f是干燥生物质含葡聚糖的分数(克/克)，干燥生物质是生物质 在发酵开始时的干重， 0.511和1.11分别是葡萄糖转化为乙醇和葡聚糖转化为葡萄糖的换算系 数。2.4.2 测定氮含量和性质将URS和SERS用10倍(V / W)的自来水洗涤三次，以确定氮含量的存在状态。对洗涤后的 样品进行风干。用凯氏定氮法对样品中总氮和不溶性氮含量进行检测 (Jones, 1991). 取0.5 克风干样品、3.5克硫酸钾、0.4g硫酸铜和10ml H2S
14、O4放入凯氏烧瓶中，反应三小时。补水 到100 ml的总体积。硼酸混合物用作指示剂溶液，将消化后产物放入蒸馏装置中。蒸馏后用 盐酸滴定法测定氮含量。可溶性氮含量的计算方法是用总氮减去不溶性氮的含量。2.4.3 潜在抑制剂的分析将5克预处理样品在25毫升蒸馏水中浸泡3小时，然后以8000转/分离心10分钟。糠醛和羟甲 基糠醛的浓度分别用配有UV检测器(G1314B)的高效液相色谱在久280处确定和Eclipse XDB-C18柱在30C用甲醇、水、乙酸混合溶液(40:59.4:0.6, v / v/ v)作为流动相在0.6 mL / min处确定(Xiao et al., 2011).。甲酸和醋
15、酸的浓度在65C下用配备了折射率检测器(G1362A) 和Aminex HPX-87H柱的H PLC用5mM H 2 SO 4作为流动相0.5 ml/m in处测定。在同一时间， 5克预处理样品在105C下干燥4小时，然后称重。抑制剂含量表示为ng/g的干燥样本。3. 结果与讨论3.1 未处理稻草和气爆稻草中氮含量及其性质氯化铵预浸渍蒸汽爆破实验将会改变稻草中的C/N比。如表一中所示，在蒸汽爆炸之前用氯 化铵溶液预浸渍，可以显著提高稻草中可溶性和不溶性氮中的含量。SERS的氮含量会随氯 化铵用量增加而增加。在1.4 MPa条件下用135 g/l氯化铵溶液预浸渍，能得到4.14%的最高 总氮含量
16、，这样比URS的效果高出2.86倍。结果显示，该预处理方式使超过80%的氯化铵流 入了稻草中，1.4 MPa条件下178C是极其重要的条件，这低于氯化铵的分解温度(330C), 所以在该过程中几乎不损失氮，流入稻草中的氮存在两种状态：水溶性氮源和非水溶性氮源 (Caneque et al., 1998). 进行洗涤可溶性氮似乎更容易扩散出来，这种方法可以用于无机氮 源。不溶性氮也会被提高到1.48%，这比URS高出0.59倍。不溶性氮据推测通过一个不明的 芳香胺的成分与SERS连接。较高的预处理温度下与铵反应，可以从半纤维素和木质素中获 得更多的降解产物(Goto et al., 1993).不溶性氮可以用于有机氮源，在同步糖化发酵过程中 释放。因此，铵可以转化成不同类型的氮资
