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1、脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白E基因多态性与2型糖尿病并发冠心病的关系【摘要】 目的 探讨2型糖尿病(T2DM)患者脂肪酸结合蛋白(FABP2)及载脂蛋白E(ApoE)与冠心病(CHD)的关系。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRPFLP)技术分别检测T2DM并发CHD组及T2DM非CHD组FABP2、ApoE基因型，并检测T2DM并发CHD组不同等位基因携带者血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HLDC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)。结果 T2DM并发CHD组FABP2 A/T突变频率高于非冠心病组(P<0.05)，T等位基因携带者与A等位基因携带者
2、相比TG、TC、LDLC浓度升高，血HDLC浓度降低，有显著性差异(P<0.05)；T2DM并CHD组4等位基因频率明显高于对照组(P<0.01)，4等位基因携带者与3等位基因携带者相比TC、LDLC浓度升高，HDLC浓度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，FABP与ApoE基因连锁分析，FABP2T基因和ApoE4基因连锁时，T2DM并发CHD的几率增加(P<0.05)。结论 FABP2 T基因及ApoE/4等位基因增高T2DM并发CHD的遗传易感性。 【关键词】 糖尿病；冠心病；脂肪酸结合蛋白；基因多态性；载脂蛋白E ABSTRACT: Objective To
3、 study the relationship of fatty acid binding protein2 (FABP2) and apolipoprotein E (ApoE) with coronary heart disease (CHD) in type2 diabetes mellitus (T2DM) patients. Methods FABP2 and ApoE gene polymorphisms were detected by PCRRFLP. At the same time all CHD in T2DM patients serum triglyceride (T
4、G), total cholesterol (TC), highdensity lipoprotein cholesterol were (HDLC), lowdensity lipoprotein cholesterol (LDLC) were detected. Results The Tallele frequencies of FABP2 were higher (P<0.05), the levels of serum TC, TG and LDLC of Tallele carriers were higher while HDLC was lower than that o
5、f Aallele carriers (P<0.05). The 3allele frequencies of ApoE were higher (P<0. 01), the levels of serum TC and LDLC of Tallele carriers were higher, but HDLC was lower than that of 3allele carriers (P<0.05). Combined analysis of FABP2 and APOE genotype showed that the FABP2T+/APOE4+genotype
6、 was a risk factor of CHD in T2DM patients (P<0.05). Conclusion FABP2T and ApoE4 alleles increse the susceptibility to CHD in T2DM. KEY WORDS: diabetes mellitus; coronary heart disease; fatty acid binding protein2; gene polymorphism; apolipoproteinE 糖尿病尤其是2 型糖尿病(T2DM)患者常伴发冠心病(coronary heart disea
7、se, CHD)，并成为糖尿病患者的主要死亡原因之一,目前认为与脂质代谢密切相关。在遗传因素中，脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein2, FABP2)及载脂蛋白E(ApoE)基因引起了医学界的极大关注。FABP2编码的小肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)，参与细胞内长链脂肪酸的吸收、转运及新陈代谢。FABP2基因编码区exon2 54位密码子的变异对于蛋白质的一级结构具有明确的影响，由此引起功能上的改变，从而可能导致脂质代谢异常、血管内皮的损伤1，为冠心病的危险因子2。载脂蛋白E有四种等位基因编码，但不同等位基因对脂质代谢的能力不同，与心脑血管疾病有关2。本研究探讨
8、了脂肪酸结合蛋白(FABP2)及载脂蛋白E(ApoE)不同等位基因与T2DM并发CHD的关系。 1 资料与方法 1.1 一般资料 2005年3月至2007年3月，蚌埠医学院附属医院内分泌科T2DM患者(1999年WHO糖尿病诊断标准)分T2DM并发冠心病组(T2DMCHD)98例，主要动脉(左主干，左前降支，左回旋支，右冠状动脉)中至少有一支内径狭窄>50%；T2DM非冠心病组(T2DMnCHD)110例，上述主要动脉中无一支内径明显狭窄或狭窄程度<50%。 1.2 方法 1.2.1 PCRPFLP检测患者FABP2、ApoE基因型 取空腹静脉血3mL，EDTA抗凝，采用酚氯仿法提
9、取DNA ，PCR扩增。FABP 引物1：5ACAGGTGTTAATATAGTGAAAAG3，引物2：5TACCCTGAGTTCAGTTCCGTC3。内切酶Hha酶切；ApoE：引物1：5TCCAAGGGCTGCAGGCGGCGCA3，引物2：5GCCCCGGCCTGGTACACTGCCA3。内切酶Afl、Hae酶切。琼脂糖电泳。 1.2.2 血脂测定 所有检测对象禁食12h后次晨抽静脉血。新鲜血标本分离血清后经不同的处理，分别上机测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)(酶法)。 1.3 统计学分析 计量资料以s表示，两组间比较用
10、t检验，计数资料组间比较采用2检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 FABP2和ApoE基因的PCRRFLP检测结果 FABP2扩增产物长度为180bp，用Hha酶切，FABP2Ala54存在Hha切点，PCR产物酶解后呈99bp及81bp两个片段，而FABP2Thr54上Hha切点消失，仅180bp一个片段, 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定基因型(图1)。 ApoE基因：ApoE扩增产物为218bp。ApoE基因型区别仅存在112及154位氨基酸残基的不同，2经限制性酶Afl酶切后大片段核苷酸长度168bp，3经限制性酶Afl和Hae双酶切，其酶切后大片段核苷酸长度为14
11、5bp，4经限制性酶Hae酶切后大片段核苷酸长度195bp。用40g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型(图2)。 2.2 T2DMCHD组和T2DMnCHD组FABP2 54位点基因型与等位基因的比较 FABP2野生型A/A和变异型A/T、T/T的基因型频率在T2DMCHD组分别为32.7%、50.1%和14.3%，T2DMnCHD组分别为55.4%、48.2%和5.4%，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。两组等位基因比较亦具有显著性差异(P<0.05，表1)。 2.3 T2DMCHD和T2DMnCHD组ApoE基因型与等位基因的比较 两组均以E3/3、E4/3基因型为主，T2
12、DMCHD组E3/3、E4/3频率分别为44.9%和36.7%，明显低于T2DMnCHD组E3/3(64.5%)而高于T2DMnCHD组E4/3；24.5%(P<0.01)；两组病例等位基因比较T2DMCHD组4等位基因频率为26.5%，显著高于T2DMnCHD(16.4%) (P=0.01)，而3等位基因频率病例组低于对照组，有统计学意义(P=0.004，表2)。 2.4 FABP2 T和ApoE4基因的联合分析 以上结果表明FABP2 T和ApoE4等位基因与T2DM并发CHD有关，联合分析FABP2 T和ApoE4基因发现FABP2T+/ApoE4+和FABP2T/ApoE4联合基
13、因型在两组之间有显著性差异(2=10.6，P=0.001；2=9.94，P=0.002)，而其他基因联合在两组间比较无统计学意义(表3)。表1 T2DMCHD与T2DMnCHD组FABP2基因型与突变基因的比较表2 T2DMCHD与T2DMnCHD组ApoE基因型与突变基因的比较表3 FABP2 T和ApoE基因与T2DM并发CHD的联合分析 2.5 T2DMCHD患者FABP2 54位点多态性与血脂水平的关系 T2DMCHD组中T等位基因携带者的空腹TG和TC水平与A等位基因携带者相比都有增加的趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，T等位基因携带者HDLC浓度低于A等位基因携带者，而
14、LDLC浓度高于A等位基因携带者，两者之间有显著性差异(P<0.05)。其他血脂数据之间均无显著性差异(表4)。表4 T2DMCHD患者FABP2各等位基因与血脂水平的比较 2.6 T2DMCHD患者ApoE等位基因与血脂水平的关系 T2DMCHD组中2等位基因携带者的空腹TC和LDLC与其他等位基因携带者相比都有增加的趋势，其差异有统计学意义(P<0.05)；而HDLC低于其他等位基因型，且有显著性差异(P<0.05)。其他血脂数据之间均无显著性差异(表5)。 表5 T2DMCHD患者不同ApoE等位基因型组间血脂水平的比较 3 讨 论 FABP2基因位于4q2 8231，
15、大约3.4kb，包括4个外显子和3个内含子。迄今为止，共发现5个FABP2基因多态性位点，其中研究最为广泛的是外显子2的密码子54位的多态性。其发生腺嘌呤置换鸟嘌呤的错义突变，导致苏氨酸置换成丙氨酸，改变了FABP2的结构与功能。体外研究发现，野生型(A/A)比突变型(A/T、T/T)结合脂肪酸的能力高2倍4，突变型比野生型具有更高的甘油三酯和胆固醇水平5。本研究中T2DMCHD组T等位基因携带者的血浆TG和TC浓度和A等位基因携带者相比都有增加的趋势，T等位基因携带者HDLC浓度低于A等位基因携带者，而LDLC浓度高于A等位基因携带者，两者之间有显著性差异(P<0.05)。T等位基因携带者TG水平升高、HDLC水平降低，这可部分地解释FABP2 T等位基因与T2DM并发冠心病的相对危险性，表明FABP2基因54位突变与T2DM并发CHD有一定的关联性。 ApoE是一种富含甘油三酯的脂蛋白，通过其与LDL受体结合，在脂质代谢中起重要作用。有报道4等位基因与冠心病的发病相关6。本实验研究4等位基因与T2DM并发CHD的相关性，结果表明4等位基因能增加T2DM患者并发CHD的危险性，这可能与4等位基因携带者TC、LDLC水平增加有关。 在FABP2和ApoE基因联合分析对T2DM并发CHD的关联性的研究中，发现FABP2 T+基因和ApoE
