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1、第 2 章 基因克隆的载体质粒和载体：携带外源 DNA 进入宿主细胞的工具。一、载体的功能：1. 运送外源基因高效转入受体细胞2. 为外源基因提供复制能力或整合能力3. 为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体应具备的条件：1. 具有对受体细胞的可转移性2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3. 长度尽可能小，以提高其载装能力4. 具有多种单一的酶切位点5. 具有合适的选择性标记附图：图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式2.1 质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双 链 DNA 分子(Covalently closed Circular D
2、NA, ccc DNA)，并不是细菌生长 所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在 1-200kb 之间。PlMMidsNucleoidPlasmids a.re smalL circuhr DNA molecules that are found inside some prokarxock celh.一、质粒的基本特性：（一）自主复制性质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因， 因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的 拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因， 所以其复
3、制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。（二）不相容性利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细 胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞 中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的 子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定 地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。（三）可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。 pMB1 或 ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子 （DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶
4、以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成 并阻断细菌染色体复制时，带有PMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料 大量复制，最后每个细胞可以积聚 2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。但另外两种质粒（psclOl和pl5A）和的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子 的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。（四）可转移性 在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转 移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。二、质粒的构建（一）天然存在的两种质粒（
5、1）colEl宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell。（2）pSC101 宿主细菌沙门氏菌 8.8kb 严谨型复制 5copy/cell 标记基因为 Tcr 质粒的命名 p 小写代表质粒；后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者 的姓名。（二）质粒人工构建的目的 天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必 须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加
6、装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。三、质粒的分类 （一）根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类：致育（fertility）质粒/F质粒：仅携带转移（tra）基因，并且除了能 够促进质粒有性结合的转移外，不再具备其他的特征，如大肠杆菌的F质粒。耐药性（resistance）质粒/ R质粒：携带有能够赋予宿主细菌对某一 种或多种抗菌药的耐药性的基因，如抗氯霉素、青霉素或水银。如RP4,发现于 假单胞杆菌。Col质粒（col plasmid）:编码大肠杆菌素，一种能够杀死其他细菌的 蛋白，如存在于 E. coli 中的 CoE1。some containfirqi FtF4O o0
7、(T) 3*轨 wrtti plHErrtdNonrisl gr口w!h modJum - hq Jintihkilie；Growth mecSum + 50 甲简iAll H4can growOnlY EhliinlngFTP四 can grow图 3-2 利用抗性基因进行重组子的筛选降解质粒（degradative plasmid）:使宿主菌能够代谢一些通常情况下无 法利用的分子，如：甲苯，水杨酸，例如，假单胞菌中的 TOL 质粒。毒性质粒（virulence plasmid）:赋予宿主菌致病性，比如根瘤农杆菌 中的Ti质粒（Ti plasmid），能够在双子叶植物中诱导冠瘿瘤。2.2 噬
8、菌体一、入DNA载体（一）入噬菌体的分子生物学入噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和入-DNA组成1）入-DNA的物理图谱入-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性 末端）GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA,称为 cos 区，全长 48.5kb。特点是功能 相近的基因在基因组中聚集在一起。例如，所有的编码外壳蛋白的基因都聚集在 左端 1/3 处；控制基因组整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是负责裂解 宿主细胞、DNA自主复制以及调控的基因；相关基因的聚集对入基因组的表达是图 3-11 cos 位点的作用2）感染周期噬菌体通过特殊的生物学方
9、式感染宿主细胞，将其DNA导入（1）吸附 吸附于大肠杆菌外膜上的 LamB 受体（正常功能是运转麦芽糖进 入细胞内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故它也可促进入噬菌体的吸附与感 染（尾部吸附）。（ 2） DNA 注入（3）DNA复制 从单一 ori区滚筒复制，形成线状多联体，入-DNA上两个基 因的产物激活复制的起始，但复制所需的蛋白因子系统则由宿主细胞提供。4）包装 包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此 cos 区对包装是至关重要的。 包装时由一个蛋白因子将 cos 区切开，从而保证只有一个 DNA 线状负责被保证在一起，每个宿主细胞可包装多达
10、100个成熟的入-DNA分子，包装对DNA 本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装入-DNA分子的75%-105%, 也就是说可以包装36.4kb-50.9kb范围内的DNA，包装好了的入-DNA便形成成熟 的噬菌体颗粒。（5）裂解 每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解 宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另 外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。X DNA eifCLila.rBactBriaJ chramaaofinoDNAInTuctiorKA 入 DNA exeiBe-Ei Incpm lio bust cJiram
11、osome/l DMA Intsgrateis/ mio im ho si ch ro0B IM曰v ph曰g P且FtiOteE髦徑曰e pffKlucedstc口石 zfi-n?d 3 of Fig. ?.6)B图3-12入噬菌体的侵染循环3）溶源状态的建立 噬菌体感染大肠杆菌后除了可能裂解细胞外，也可能直接整合到宿主细胞 的染色体DNA上，并不裂解细菌，这种情况的为溶源状态，整合重要由-DNA上 的 cI 和 int 两基因的产物所激活，而这个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞 本身的性质。人们可以根据需要改变入-DNA或宿主细胞的性质，使入-DNA或处 于溶菌状态，或处于溶菌状态。（二）
12、入-DNA载体的构建 建立入克隆载体前需要解决2个问题：1）入DNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。2） 入基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切 后产生多个片段，连接不能形成入基因组。I. 缩短长度野生型入一DNA包装的上限为50.5kb,本身长度为48.5kb,那么外源DNA 片段允许插入的大小至多为2.4kb,这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒, 如果将缩短便提高装载量。其实入一DNA上约有40-50%的DNA片段是复制，裂解 所不必需的,将之切除便可提高载量。Capsid componants b2理 o 工 I uolrtnmal
13、UPIB-Flmaj Ape 山UOUDKV PUN 4匚-图3-13入-DNA的结构II.修饰酶切识别位点天然的入-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，Hindlll 7个，这些多余的 酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的入品系。自然 选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的入DNA分子会 被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺 失了。Few rnGilft plaquss图3-16通过自然选择法筛选无Ecorl识别位点的入-噬菌体Notfmal X DMAVery 阳w piaqug-j;EcpAiRe
14、peat wMi&dlion wfth mutant即旳寻1J Second nmilzsnl 甲 phago SilrainPlajQuo fonnsd bymutflfvt phi.yA0nly 5 :口Gl_S9II8&（三）入-DNA作为载体的优点1）入-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌2）入-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载 量3）重组入-DNA的筛选较为方便4）重组入-DNA分子的提取比质粒容易 二、柯斯质粒（粘性质粒， cosmid）（一）柯斯质粒的构建入-DNA载体的最大装载量为25kb,有的往往需要构建克隆更大的外源DNA
15、片段，柯斯质粒就是应这种需要而人工组建的。柯斯质粒顾名思义就是含有入-DNA两端cos区的质粒。由于入-DNA包装时， 其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约 1.5kb 长。如果将这一小段 DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍 可象入-DNA 一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌， 与噬菌体DNA所不同的是，柯斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的 制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。图 3-17 Cos 质粒 pJB8（二） 柯斯质粒的优越性：1）能象入-DNA 一样体外包装，并高效导入受体细胞2）可以装载比质粒或入-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA3）由于携带质粒的选择标记，便于筛选4） 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。图 3-18 利用 Cos 质粒进行克隆BamHlCimliMr pd&dNew DNAInfectAmp
