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1、课题名称协作单位 研究期限 研究类别 填表日期科研项目申请书TKTL1和DNASE1L1蛋白在肿瘤早期诊断中的应用 北京金沐医疗科技有限公司2017年-2019年预防医学2016年8月17日一、摘要研究项名称TKTL1和DNASE1L1蛋白在肿瘤早期诊断中的应用类别基础研究学科分类医学申报学科领域肿瘤学项目依托实验室 中国医学科学院肿瘤研究所主姓名张春光性别男民族汉出生年月持职称学位硕士其它人所在单位北京金沐医疗科技有限公司总人数高级中级初级博士硕士生其他参加单位数姓年龄职称所在单位项目中的分工项目组成员申请经费起止年月研 摘要：不超过300字（概括研究的对象、研究方法，关健问题、标志性成果等
2、）究 内 容 和意 义肿瘤是导致人类的第一大死因，严重威胁人类的健康。目前针对肿瘤的治疗方案 还不完善。临床研究表明，早期发现与早期治疗是根治肿瘤的唯 途径。现阶段 市场上用于肿瘤早期筛查的标志物都存在明显的缺陷，从而不能做到对肿瘤疾病 的早期筛查，诊断与治疗。TKTL1和DNASE1L1是新发现的与肿瘤生长相关的特异 性蛋白。TKTL1作为转酮酶在肿瘤细胞粗放的代谢过程中起着至关重要的作用，而 这种大量消耗葡萄糖的无氧酵解代谢方式也是肿瘤细胞区别正常细胞的一个标 志。DNASE1L1在细胞凋亡过程中降解DNA起关键的作用。这两个蛋白在肿瘤细胞 中特异性咼表达，且在巨噬细胞中可以被富集和检测。
3、通过检测巨噬细胞中被吞 噬的肿瘤相关蛋白TKTL1和DNASE1L1的表达水平可以对早期肿瘤进行筛查与检 测。主题1.主题词数量不多于三个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）。中文英文二、立项依据与研究内容（1）项目的立项依据单核/巨噬细胞是人类免疫系统细胞的重要组成部分。人类外周血细胞可以 主要分为无核细胞（主要为血红细胞）和有核细胞（白细胞等）。单核细胞约 占有核细胞总数的 5%左右，由髓系造血祖细胞分化而来，是免疫系统中抗原递 呈细胞（APC细胞）的重要组分。其在人体循环系统内成熟分化并实现免疫学 功能可以大致分为以下步骤：毛细血管中的单核细胞f透过血管壁进入血管外 组织f发现异源性物
4、质（细菌、病原体、肿瘤细胞等），分化为成熟的巨噬细 胞f吞噬并消化，将抗原递呈到特定的细胞表面分子上f经由淋巴管回流到外 周血f完成抗原递呈激活杀伤性免疫细胞。作为机体抗击外来病原侵袭和清楚 自身非正常细胞机制的哨兵，巨噬细胞是免疫系统形成免疫应答的重要环节， 作用重大。在正常人体内每时每刻都有向着肿瘤化（永生化、非正常凋亡）发 展的细胞产生，正常的机体免疫机制可以通过上述过程，将其及时清除。但随 着肿瘤细胞的演化，生成了躲避免疫杀伤的机制，或者机体总体免疫力的下降， 形成免疫逃逸，最终在患者体内形成肿瘤包块。由此可见无论健康人群还是癌 症患者体内巨噬细胞对于肿瘤化细胞的吞噬作用，都是无时无刻
5、不在进行的。 针对单核/巨噬细胞内肿瘤来源物质（包括蛋白质、核算、脂类等）的观测，可 以为我们提供一个监控体内肿瘤发生、发展的崭新视角，其应用前景必然非常 广泛。肿瘤是目前世界第二大死因，严重威胁人类健康。尽管现代医学飞速发展， 并且在肿瘤研究和治疗方面也不断大量投入，但是当肿瘤发生局部扩散和远端转 移等后期阶段时，现代治疗手段也是一筹莫展，对肿瘤治疗收效甚微；而许多患 者的肿瘤在被诊断时已经处于晚期阶段。在过去几十年中，这些晚期肿瘤患者的 5 年生存率没有发生太大变化。相反的是，早期肿瘤患者的预后相对来说要好很 多。现代医学科学的进步和先进的医疗手段对于早期阶段的肿瘤，特别是原位肿 瘤的治疗
6、具有显著的疗效。因此，现代医学已经把重点聚焦于肿瘤的早期发现， 使肿瘤在发展到晚期之前得到有效的治疗。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生、发展过程中，由肿瘤细胞本身所产生的、或 者由机体应对肿瘤细胞而产生的特异性分子。这些分子可以反映肿瘤的存在和进 展，往往特异性出现在肿瘤患者，而在正常人不存在、或其表达水平与肿瘤患者 相比有显著差异。目前发现的具有临床意义的 100 多种肿瘤标志物中，有一大部 分是存在于患者的血液中，比如许多肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异或癌胚抗 原，肿瘤相关抗体或自身抗体等。这些血清中的肿瘤标志物的存在给肿瘤早期的 检测和诊断提供了可能和便捷途径。现有的关于肿瘤标志物的检测技术
7、主要包括肿瘤基因测序以及 ctDNA 测序 技术。其中，肿瘤基因测序是应用肿瘤活检组织提取DNA测序，主要用以辅助 诊断和指导个体化用药，该检测技术为有创取样，必须先明确肿瘤病灶发生位置， 不能用在早诊筛查领域。ctDNA测序是分离富集外周血中游离的肿瘤DNA并进 行测序，目前主要应用集中在肿瘤复发监控、用药指导等方面，然而，由于外周 血中 ctDNA 含量稀少，尤其在肿瘤早期阶段收集不到足够用于测序实验的 ctDNA量，故该方法应用受到很大限制。单核/巨噬细胞作为有核细胞的重要组分，现有技术一般是通过其表面抗原分子 CD14 和 CD16 进行检测的，目前可以买到成熟的抗体。主要的临床应用
8、集中在血细胞组成检测和造血系统肿瘤（如：粒/单核细胞性白血病）方面的检 测中，为临床诊断提供重要参考。就目前专利和文献检索来看，将肿瘤抗原与实体肿瘤的监控联系还有待进一步研究。参考文献：2）项目的研究内容、研究目标, 以及拟解决的关键科学问题1研究目标本项目致力于TKTL1和DNASE1L1在肿瘤检测中的应用研究。我们通过在病 人血液中寻找吞噬相关的细胞，在这些细胞中寻找肿瘤相关的分子：如蛋白，核 酸等。该项目中，我们通过检测巨噬细胞中TKTL1和DNASE1L1的表达量，来确 定病人身体内肿瘤发生发展状况，根据本项检测，给病人的肿瘤诊断，治疗及预 后提供建议和数据支持。2研究内容 TKTL1
9、和DNASE1L1特异性抗体的制备在TKTL1和DNASE1L1蛋白序列中选出抗原性和特异性较好的多肽片段用 作抗原，合成多肽免疫小鼠，制备融合细胞株；通过筛选，获得表达量和特异性 较好的细胞株，ELISA验证后，大量表达这两个蛋白的抗体，并用荧光分子分别 标记这两个抗体。 TKTL1和DNASE1L1特异性抗体验证用流式细胞术的方法验证这两个蛋白抗体的特异性。抗体标记的肿瘤细胞系 用流式细胞术的方法检测，统计阳性细胞率来计算该抗体的特异性。在病人的血 样中分离出白细胞，TKTL 1或DNASE1L1标记后流式细胞术检测，验证抗体的特 异性。该实验都采取严格的空白对照和阴性对照。 TKTL1或
10、DNASE1L1阳性的巨噬细胞的检测在病人的血液样品中用CD14和CD16的抗体标记巨噬细胞的表面分子，用 TKTL 1和DNASE1L1标记巨噬细胞吞噬的肿瘤细胞标志物，流式细胞术分析4中 分子阳性的细胞，即TKTL 1和DNASE1L1阳性的巨噬细胞，从而获得病人体内是 否含有大量的肿瘤细胞的信息。 结果分析和身体状况的预测通过对TKTL1和DNASE1L1阳性的巨噬细胞和TKTL1和DNASE1L1阴性的 巨噬细胞进行比较，获得这两类细胞的数量比值，分析这个比值的大小与肿瘤大 小和恶性程度的相关性，验证这两个蛋白作为早期肿瘤标志物的可行性，以及这 两种蛋白对早期肿瘤预测的灵敏度和特异性。
11、3拟解决的关键科学问题通过制备TKTL 1和DNASE1L1的特异性抗体，检测巨噬细胞中肿瘤来源的 TKTL1和DNASE1L1的量来检测病人体内的肿瘤相关信息。通过大量的临床验本 检测分析，得出这两个蛋白与肿瘤的发生发展之间的相关性，以及该蛋白在肿瘤 检测中的灵敏度和特异性，从而建立通过检测巨噬细胞中这两个蛋白的量来检测 肿瘤的方法。（3）拟采取的研究方案及可行性分析1拟采取的研究方法 对TKTL1和DNASE1L1蛋白序列进行分析，获得免疫原性较高和特异性较好 的多肽片段。合成多肽，制备抗原。 多肽免疫小鼠，制备融合细胞，筛选后检测抗体的表达量和特异性。 用CD14, CD16, TKTL
12、1和DNASE1L1抗体筛选出含有肿瘤相关分子的巨噬 细胞和不含有肿瘤相关分子的巨噬细胞。 通过对大量临床实验结果的分析，得出该检测在肿瘤筛查中的特异性和灵敏 度。2技术路线3实验方案 目的基因的分子克隆与目标蛋白的表达在文献调查及序列比对的基础上，根据NCBI基因序列，从原核生物中提取 总RNA,设计引物经过RT-PCR及PCR扩增得到原核细菌Cas3的全长基因，构建 表达载体，在原核细胞中表达重组蛋白。 目标蛋白的纯化和鉴定用亲和层析法、离子交换层析等方法纯化重组蛋白；用SDS-PAGE和质谱鉴 定重组蛋白表达是否正确；用动态光散射、分子筛鉴定重组蛋白的聚集状态；用 核酸结合试验鉴定蛋白的
13、生物学活性。 蛋白的晶体筛选和优化先采用座滴法，使用用商品化晶体筛选试剂盒筛选晶体生长的初始条件，再 采用悬挂-滴落蒸发扩散法自配溶液对初筛的晶体条件进行优化，获得最佳分辨 率的蛋白晶体。 自由蛋白结构的解析采用X-射线衍射Cas3自由蛋白，用MAR图像探测器获得衍射数据，收集到 的数据用H KL2000程序分析，采用制备目的蛋白硒代甲硫氨酸衍生物及重原子浸 泡的方法，确定蛋白的相位解，进而解析蛋白质结构。 蛋白质功能分析采用凝胶迁移实验（EMSA）等方法对蛋白进行功能分析，通过ITC研究蛋 白与核酸的亲和力及结合的稳定性，预测出Cas3蛋白与DNA结合的保守位点， 并对这些位点进行突变，研究
14、这些突变位点是否影响蛋白的生物学功能。 蛋白与DNA复合物的研究根据功能分析结果，制备Cas3-DNA的复合物，筛选并解析复合物晶体的结 构，找出Cas3蛋白与和核酸结合的方式和细节，进一步解释CRISPR/Cas系统对 外源病毒及遗传物质入侵的作用机制。4 可行性分析 本研究小组以CRISPR/Cas系统相关蛋白的结构研究为主要科研方向本研究小组在国内率先开展CRISPR/Cas系统相关蛋白结构研究，先后克隆 并表达了多种原核生物I型、II型、III型CRISPR/Cas系统中的CaslCas5、Cas9及 Cascade复合体蛋白，进行了大量结构生物学方面的研究，为本项目的研究奠定 了基础
15、。 本研究小组已成功解析了部分Cas3蛋白的结构在前期研究中，本研究小组成功克隆并表达了可溶性的原核生物全长Cas3 蛋白，功能分析表明，该蛋白具有切割双链和单链DNA的活性，证明其具有生 物学活性；通过X-射线晶体学方法，首次解析了Cas3蛋白C-端解旋酶结构域的结 构，并获得了一套全长Cas3蛋白的低分辨率硒代甲硫氨酸的数据，求得了初步相 位。以上工作为后续结构解析Cas3全长蛋白及Cas3-DNA复合物结构研究创造了 条件。 本研究小组所依托的实验平台条件优越本项目已非编码核酸重点实验室为依托，与国家生物大分子实验室公用实验 平台，拥有良好的仪器设备，有PCR仪、蛋白/核酸电泳系统、DNA成像仪、大 型摇床、细胞高压破碎仪、PFLC快速蛋白纯化仪、purfier蛋白纯化系统、晶体 检测专用显微镜及CCD拍照设备、晶体筛选试剂盒、晶体培养室等先进仪器。(4) 本项目的特色与创新之处1本研究首次开展对原核生物CRISPR/Cas系统中核心蛋白Cas3全长进行结
