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1、* *化能异养微生物的分离与纯化（综合）安排说明：本实验要求以实验小组为单位完成。第8周起，各小组应该下载相关资料，做好预习（器材申报与领用）。集中实验时间：11周13周。11周：提交实验材料要求清单一式两份，一份上交，弁根据清单领取器材。12周：开展实验，实验完成后整理实验结果，撰写实验报告。13周：完成整个实验器材归还。本次实验考评占实验总成绩的 20%!考评内容包括实验纪律、操作技术、实验报告。实验结果组内共用，实验报告自己写。注意：期末实验课成绩 =实验考试（卷面成绩、操作各占50%） 50%+实验报告20%+综合、 设计实验成绩20%+平时成绩10%）第一部分：实验原理及目的要求目的
2、要求1 ?掌握细菌、放线菌、酯母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。2 ?学习从样品中分离、纯化出所需菌株。3 ?学习弁掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酯母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。4 ?学习平板菌落计数法。基本原理不同土壤是微生物生活的大本营， 是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酯母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；白面曲（发面用的引子）或酒曲或果园土
3、中分离酯母菌。1）为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。2）其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品中各类微生物的相互干扰，通常需要使用不同的培养基，进行富集和选择培养。如细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多？但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10颉或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌（如加链霉素25-50/mL以抑制细菌；添加制霉菌素50/ mL或多菌灵30呃/ mL以抑制霉菌）;酯母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酯母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酯母菌在pH 5
4、时生长极快。细菌生长适宜的酸碱度为 pH7,所以分离酯母菌时只要选择好适宜的培养基和pH,可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酯母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前须添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。3）要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。四大类微生物的分离培养基、培养温度、培养时间见表表1四大类微生物的分离条件样品来源分离对象稀释度培养基名称培养温度-C)培亦时间/d土样细菌10-5 , 10 6、7,10牛肉膏蛋白豚303612土样放线菌710-3 , 10-4
5、,10-5高氏1号2857土样霉菌10-2 , 10-3 ,104马丁氏培养基283035面曲或土样酵母菌10-4 , 10-5 ,10-5豆芽汁培养基283023细菌分离平板细菌单菌落牛肉膏蛋白豚303712注：本实验的目标在于两项核心实验操作技能（按美国微生物学会核心课程实验操作技能第3条）：1）无菌操作技术一一包括灭菌技术及保持相关器具的无菌状态；无菌操作技术；获得微生物样本；2）梯度稀释技术估算微生物的数目一一正确选择和使用移液管和移液装置；正确涂布样本以准确计数；估计所需要稀释的倍数；根据平板计数值推测出起始样本的CFU或PFU第二部分：综合性实验一一化能异养微生物的分离纯化（自主实
6、验设计与要求）一、分离四大类微生物（细菌、放线菌、酯母、霉菌） ，要求每类型微生物各分离到2株菌，纯化后以斜面（8支）的形式交验；计算所采集土壤中的细菌含量（CFU要求交验计数所 用的12块平板）。二、技术达标1. 培养基的配制：根据不同微生物的营养需要特点，配制相应的培养基，弁进行培养基的验证。2?掌握梯度稀释法、划线法基本技术，其中划线法要求每人独立完成一份。3 .对所分离的菌株其菌落特征的表述（列表） 。4 .小组的管理与合作。三、实验结果与汇报1.综合报告：全组撰写一份综合报告。含预方案（主要是器材计划、时间安排），执行记录，结论以及综合分析。可按需要自行设计表格，规范执行、规范记录。
7、报告的写作，请严格按照我院报告的格式要求，弁参考网络课程中“实验报告互评的评分要求”中的相关要求执行。2.个人实验报告：每人一份实验报告，重点报告实验现象、观察思考，结果分析，综合体会等，不涉及方案及实验原理、步骤等的记录。3实验汇报，以实验小组为单位，制作PPT,交流。小组互评，推优。四、实验安排与完成时间1 .本周完成方案学习与器材申请，弁填写附表 1、2相关内容。（见附录）本周、下周为集中实验时间，在实验课所安排的时间，由实验老师集中指导。各组也可自行安排实验时间，在实验小班科代表的统一安排下，联系实验室开展实验。2 .完成时间：十五周前。本次练习中建议同学们利用实验室提供的材料，自己练
8、习棉塞的制作。第三部分 实验内容（技术要求参考资料）提示：本次实验所提供的方案仅供参考。各组在达到目的的情况下，可以自行设计自己的方案，但本方案中所提到的实验操作细节，对实验质量的把握很有帮助，值得关注。材料与用品1 .菌源 选定采土地点后， 铲去表土层2? 3cm，取3? 10cm深层土壤10g，装入已灭过菌 的牛皮纸袋内.封好袋口，弁记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。从 面曲中分离酯母菌，也可用酒曲等替代。2 ?培养基肉膏蛋白陈培养基（）、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基、豆芬汁葡萄糖培养基（注意：需要制
9、平板和斜面，划线法所用固体培养基，建议琼脂浓度为22.5%,使平 板具有一定的硬度，便于划线操作 ）3 .无菌水或无菌生理盐水配制生理盐水.分装于250mL锥形瓶中，每瓶装 99mL （或95mL分离霉菌用）,每瓶内装10粒玻璃珠；分装试管，每管装约4.55mL （不超过试管高度的1/5 ） o4 .其他试剂与用品无菌培养皿、无菌移液管、无菌涂棒（刮刀卜称量纸、药匙、洗耳球、10姗溶液各组根据实验要求，统计后以表格形式申报所需要材料（参考表2）1微生物的分离及纯化培养微生物的分离与纯化常用技术主要包括稀释分离法、划线分离法。稀释分离法将样液进行梯度稀释后，结合所需要分离的菌种特点，选择一定稀释
10、度的样液进行接种培养，或涂布法或混菌法，对已经稀释的样液中的菌体进行培养，获得菌落纯的细胞。划线法可以直接获得单菌落。*稀释分离法通过稀释，结合平板分离的纯化菌株的方法有倾注法和涂布法两种。本次实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，酯母菌分离采用涂布法。以下以细菌及放线菌的分离为例说明技术要点： 1）细菌的分离A制备土壤稀释液：称取土样1 g,在火焰旁加入盛有 99mL弁装有玻璃珠的无菌水 或无菌生理盐水锥形瓶中？振荡1020mi n ,使土样中菌体、芬抱或抱子均匀分散，制成10 -2稀释度的土壤稀释液，然后按10倍稀释法进行稀释分离。具体操作技术要点如下：取 4.5 mL无菌水试管6支，按
11、10-210-7顺序编号，放置在试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除下段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2? 3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞（棉塞夹在手上，不能乱放在桌上），将1mL移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸二次（吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），
12、然后准确吸取 0.5mL 10 -2 土壤稀释液（吸管插入稀释液不低于 2.5cm反复冲洗10次左右，吸液高于所需要刻度少许，然后提起吸管贴于容器内壁取出所需要体积；靠近液面但不接触液面的情况下将液体缓慢吹出到第二个容器（第一级稀释液所用吸管不得接触第二级稀释液），右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5mL无菌水的试管，依前法在火焰旁拔除试管帽（或 棉塞），将0.5mL 10-2 土壤稀释液注入 4.5mL无菌水试管内，制成10-3的土壤稀释液，将 此移液管通过 火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。另取一只未用过的无菌移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，
13、弁将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽。右手持10-3稀释液试管在左手十敲打20? 30次。混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已很匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出0.5mL 10 -3的稀释液置于第二支装有4.5 mL无菌水试管中，制成 10-4 土壤稀释液。同法再制成10-5、10-6、10-7的土壤稀释液（为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管）。用完的移液管重新放人纸套内。最后应该统一待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中？用3%-5麻苏尔浸泡I h后再洗涤。B倾注法分离取无菌培养皿69套，分别于培
14、养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10-7 土壤稀释液开始吸取 1mL稀释液，按无菌操作技术加到和应编号的无菌培养皿内。再依同方法分别吸取1mL I0-6、10-5的土壤稀释液，各加到和应编号为10-6、10-5的无菌培养皿内。将已灭菌的肉膏蛋白豚固体培养基融化，待冷 却至4550 C 左右（医学标准的要求是 45 1 C ）,分别倾入到已盛有I0-5、10-6、10-7 土壤 稀释液的无菌培养皿 内。注意：温度过图易将菌烫死，且皿盖上冷凝水太多，会影响 分离 效果；低于45 C培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不 平。用左 手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正
15、好伸入，倾入培养基约12?15 mL,将培养皿在桌面上轻轻转动（标准要求是：以约15cm直径范围，顺时针方向轻轻移动平皿6次，再以15cm直径范围前后移动平皿6次，并重复往返1次），使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合 均匀.混匀后静置桌上，待凝。C培养 待平板完全冷凝后，将平扳倒置于35 37 C恒温培养箱中，倒置培养24?48h观察结果。（2）放线菌、酪母的分离A制备土壤稀释液称取土样I g ，加入盛有99mL弁装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中.弁加人10滴10姗溶液抑制细菌生长（也可用I %勺重铭酸钾?液代替 10%&溶液？效果更好）。振荡后静置5min,即成10-2 土壤稀释液。B
