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1、融合蛋白柔性lin k er的选择作者: 日期:蛋白融合Linke r的设计与选择接头序列(Link e r)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为 一条单一的肽链,其中起连接作用的氨基酸称为L ink e r 1 。融合蛋白中的 两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性，与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中 的1 in k e r不能影响目的蛋白各自的功能。因此， Li n k e r序列的设计和选择 对融合基因的构建至关重要。针对L i nker序
2、列的设计和选择己有诸多相关的研究2。目前的研究主要有 两种,即螺旋形式的L in ker肽如A (EAA A K)nA和低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的接头，以后者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分，使之能在互不干扰的情况下充分折叠成各自的天然构象。Ry o ic hi等3 在两种不同功能的融合蛋 白之间插入了不同类型的link er序列，包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、 柔性li n k e r以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)。结果发现螺旋状的1 inker同柔性lin k 6 1及卩A一样，可以有效的将融合蛋白的两个结构域分开，甚至可
3、增强融合 蛋白的功能。Linke r的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。如果Linker的长度过长，则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感，导致活性融合蛋白在生产过 程中的产量下降；应用较短的L in ker,可以克服重组蛋白酶分解的问题，但可 使两个融合分子相距太近导致蛋白功能的丧失。L in ker的长度不应小于3 .5 n m ,这是由于相邻肽键的距离为0. 3 8 n m ,因此连接肽至少应包含10个氨基 酸。目前最为常用的是 H u st o n设计合成的(GGGGS)3序列。研究发现,连 接肽为(Gly4Ser )3的融合蛋白表现出较高的复性效率。这可能是(Gly4Ser)3连接肽较长且
4、柔软，在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻，从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。所以，Link e r的长度不能过长也不能 过短。Link e r的选择，还应考虑Link e r内部的氨基酸序列,研究发现,Link er组 成相同但序列不同时，构建的融合蛋白的稳定性存在显著差异；编码L inke r 的核苷酸组成,调整编码Linke r的核苷酸组成,虽不改变原接头L inker的 氨基酸序列，但融合蛋白的表达存在显著差异。L inke r序列中有太多的a螺 旋和B角结构会限制融合蛋白的伸缩性，进而影响融合蛋白的生物学活性。总之, L in ker的选择不是一成不变的，而要根据融合
5、蛋白分子的大小和特性来决定。细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一大类多功能、高活性的生物物质。它在介导机体多种免疫反应及对各类免疫活性细胞的分化、发育和活化中起着十分重要的作用。细胞因子融合蛋白(cy t okine fus ion protein)技术是当今免疫学研究的一个热点方向。该方法是基于这些细胞因子具有相同或相关的功能活性而各自作用靶点 不同，利用基因工程技术将两种或多种细胞因子融合在一起，其融合基因表达产物既具有其组成因子独特的生物学活性或使其某些活性显著提高，还可能会通过生物学活性的互补及协同效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具备的复合生物学功能，甚至还可
6、能会产生一些新的结构及生物学功能，这种新型的人工蛋白具有极高的应用价值和良好的发展前景。早在1 986年S eno等用含Ec oR I的12个核苷酸（4肽）CCGGA A TT CA TG为接 头，将I F N拟丫和I L拟2片段加以连接,结果发现产生的融合蛋白具有IFN拟丫与IL拟2的双重活性。迄今为止，国内外已相继报道了多种有价值的细胞因子融合蛋白。现就细胞 因子融合蛋白技术的原则、构建类型、应用现状以及发展前景做一简要概述。1细胞因子蛋白融合技术1.1蛋白融合的构建原则基因工程构建细胞因子融合蛋白须满足以下几个条件：（1）各融合分子的目的 D NA片段置于同一套调控序列（包括启动子、增强
7、子、 核糖体结合序列、终止子等）的控制之下。（2）融合分子间须以富含疏水性氨基酸的接头Lin ker连接,同时也要考虑接头序列的长度和核苷酸、氨基酸的组成、排列顺序等因素。如融合蛋白内部接头的不同，可导致融合蛋白各部分化学结构的改变，而影响到各融合分子的空间构象，导致其生物学活性差异。所以，设计肽链之间的接头时，要尽可能不影响两端蛋白的自然折叠， 使各融合成分互不干扰。（3）为了保证融合蛋白的生物学活性，还需考虑构成融合蛋白各成份本身的特性及其相互作用机制。如肿瘤坏死因子（TNF ）和a干扰素（IFN拟a）抑制肿瘤细胞、增强抗病毒活性等方面有协同作用。有学者构建了 TNF和IFN拟a的融合蛋白
8、，但发现该融合蛋白的抗病毒和抗肿瘤活性与单独应用TNF和I FN拟a相比，抗病毒活性降低24倍，抗肿瘤活性降低15倍，与构建融合蛋白的初衷相背。分析原因，可能是这两种细胞因子的理化性质差异较大,IF N拟a活性稳定，而TN F活性极易丧失，其融合蛋白在一定程度上影响了彼此的活性。1 . 2蛋白融合Li nk e r的设计与选择 接头序列（L i nker）设计是基因融合技术能否 成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链，其中起连接作用的氨基酸称为Li nk er1。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发
9、挥生物学活性，与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的lin ker不能影响目的蛋白各自的功能。因此，Li n ke r序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。针对L i nke r序列的设计和选择己有诸多相关的研究2 。目前的研究主要有两种，即螺旋形式的Li nker肽如A（EAA AK ）n A 和低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的接头,以后者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分，使之能在互不干扰的情况下充分折叠成各自的天然构象。Ryoichi等3 在两种不同功能的融合蛋白之间插入了不同类型的
10、linker序列，包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、 柔性1 i n k e r以及葡萄糖球菌蛋白A （PA）。结果发现螺旋状的linker 同柔性li n k er及PA样，可以有效的将融合蛋白的两个结构域分开，甚至可增强融合蛋白的功能。L i n ker的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。如果Link er的长度过长，则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感，导致活性融合蛋白在生产过程中的产量下降；应用较短的L ink er ,可以克服重组蛋白酶分解的问题，但可使两个融合分子相距太近导致蛋白功能的丧失。Lin ke r的长度不应小于3.5nm ,这是由于相邻肽键的距离为0.3 8 nm,因此连接肽
11、至少应包含10个氨基酸。目前最为常用的是 Hu s ton设计合成的(GGGGS)3序列。研究发现,连接肽为(Gl y4 Se r) 3的融合蛋白表现出较高的复性效率。这 可能是(Gl y 4Ser) 3连接肽较长且柔软，在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻，从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。所以，L i nker的长度不能过长也不能过短。Linker的选择，还应考虑Linker内部的氨基酸序列，研究发现，Link e r组成相同但序列 不同时，构建的融合蛋白的稳定性存在显著差异；编码Linker的核苷酸组成，调整编码Link er的核苷酸组成，虽不改变原接头 Link e r
12、的氨基酸序列，但融合蛋白的表达存在显著 差异Li n k er序列中有太多的a螺旋和B角结构会限制融合蛋白的伸缩性，进而影响融合蛋白的生物学活性。总之 ，L inker的选择不是一成不变的，而要根据融合蛋白分子的大 小和特性来决定。2细胞因子融合方式及其应用根据细胞因子融合分子的不同，可把细胞因子融合蛋白大致分成以下几类：2. 1不同或相同细胞因子的融合蛋白细胞因子具有多功能性和通用性，其作用的靶点各有不同。利用细胞因子的这一特点，可以通过基因融合技术创制出更佳的细胞因子融合蛋 白，其融合基因表达产物很可能表现出双因子简单配伍所没有的复合功能，而且有可能会增强各个组份间的协同作用。IL拟3和G
13、M拟CSF均为造血刺激因子，它们对不同发育阶段的造血干细胞及祖细胞 均具有促增殖和分化的作用，且共用受体B链。鉴于两者功能互补，Curtis等于1991年构建并报道了第一个由不同细胞因子组成的融合蛋白抑人G M拟CS F/I L灵3和IL拟3 / GM拟CS F融合蛋白，分别称为P1X 丫拟321和P I X丫掳1 344。为确保其各自的天然构象，在GM拟C SF与I L拟3两者之间均引入了一段疏水氨基酸序列，从而保证其与受体的结合。体外受体结合实验证明，PIXY拟3 2 1与只表达IL拟3受体的J M槪1细胞株或只表达GM拟,CS F的HL拟6 0细胞株结合时其亲和力比单体略高，说明该融合蛋
14、白可经IL拟3、 G M必CSF结构域与其各自的受体结合。同时，PIXY 3 2 1对AML撅1 9 3细胞株的增殖作用及刺激骨髓集落的形成都明显高于单独使用IL拟3、 GM槻CSF或IL拟3加GM拟CSF的作用，其作用可提高510倍。IL拟2、 IL拟6是两个具有多种免疫调节活性的细胞因子。19 9 2年Fer na d等构建了两个人IL拟2/1 L拟6融合基因，目的在于构建表达一种具有双重功能的免疫调节因子，实验表明融合蛋白与野生型IL拟2的活性一致， 较I L1X 6活性中度下降。出现此结果的原因可能是由于局部构象的改变或者是 IL拟2与I L撅6之间的相互作用干扰所致。体外 进一步研究
15、表明，该融合蛋白既可诱导T、B细胞表达IL拟2R和IL拟6R，并且还可作为分子桥梁促进和稳定T、E细胞间的相互作用。国内的赵春华等也构建和高效表达了具有促进细胞集落形成、促进L AK的增殖作用的IL拟2 /IL拟6融合蛋白。将两种相同的细胞因子融合在一起也可以起到明显的生物学功能。马大龙等构建了人双体 IL徵6、双体IL拟3融合蛋白，研究表明双体I L拟6与单体IL 以6在生物学活性上差别不大，但双体IL拟3对人骨髓细胞的集落刺激作用明显高于单体IL拟3的作用。1 L拟7是T、 E淋巴细胞成熟分化过程中重要的细胞因子,可以增强成熟T细胞的增殖及其功能,并有促进CTL增殖、分化并加强其杀伤活性,刺激LAK细胞活性的能力。Lai等4用一段柔性接头将IL拟7和人肝细胞生长因子 B片段（h epatoc y te growth fact or beta2 chai n, HGF beta）连接，结果发现融合蛋白能选择性的高效刺激B祖细胞系的增殖。胰岛素样生长因子（I G F）常与其他生长因子一起发挥协同作用，是最好的二联细胞因子融合蛋白的备选因子。IGF II可刺激多种组织中细胞的增殖或分化。将
