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1、阳药科大学本科毕业论文论文题目：化合物A联合化合物B对人肝癌HepG2细胞作用机制研起止时间：2014年10月26日一2015年6月20日学号： 学院专业:年级班级:指导教师:XXX副教授实习单位：XXX大学生命科学与生物制药学院药理系中文摘要1英文摘要2第1章绪论31.1细胞凋亡31.2立题依据5第2章实验部分62.1实验材料62.2实验方法72.3实验结果12第3章结论与讨论173.1结论173.2讨论18参考文献21致23摘要原发性肝癌是世界常见的恶性肿瘤之一，也是我国的高发恶性肿瘤，由于不易被早期诊 断，进展迅速，术后容易复发、转移，因此预后较差。目前肝癌仍以外科手术为公认首选和 主要
2、的治疗手段，但由于很多肝癌患者确诊时已是中晚期，失去了手术治疗的机会并于诊断 后1年死亡，手术切除率30%，术后总体5年生存率仅30%40%。对于可手术的肝癌患者， 术后复发、转移是影响治疗效果及预后的主要因素，对于不能手术的中晚期肝癌患者尚缺乏 有效的治疗方法。传统的化疗、放疗对肝癌疗效欠佳，目前仍缺乏行之有效的化学预防和治 疗靶位1因而本课题是对化合物A联合化合物B对人肝癌HepG2细胞作用机制研究。本实验首先用MTT法分别测得不同浓度的A和B单独处理HepG2细胞及不同浓度的A和 B联合用药处理HepG2细胞死亡的影响。结果表明不同浓度的A和B单独处理HepG2细胞， 增值抑制程度表现为
3、时间剂量依赖效应，并且在A 6umol/ 1联合8 100umol/L协同作用最 为显著。流式细胞仪检测细胞凋亡率显示，联合用药组凋亡率升高更为明显。Western Blot 法检测蛋白显示，促凋亡相关蛋白Bax、FADD增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。关键词联合用药，细胞凋亡，作用机制AbstractHepatocellular carcinoma (HCC) is the most common cancer in the world and an increased malignant illness in our country. Because of its aggressive
4、 biological behavior, rapidly progresses and delayed diagnosis, this malignancy has a grim prognosis even following surgical resection and has high disease-recurrence. Surgery is the first and most common therapy of HCC. Unfortunately, the disease is usually detected at an advanced stage, and the ma
5、jor patients lose the chance of surgery, die within 1year after the diagnosis of their disease. Relative survivor are 30% and 30%40% respectively. The high disease recurrence and metastasis are the important reasons for effect and prognosis. Curative therapies are least effective for surgically case
6、s. For these patients, medical treatments, including chemotherapy, chemo-embolization, ablation, radiotherapy, remain disappointing. Clearly, there is an urgent need for new therapies for this aggressive disease because effective prevent and targets of therapy are unavailable. Therefore this issue i
7、s the mechanism of the Joint Drug B, Drug A, on HepG2 cells is significant.This article assessed the effects of drug A alone, drug B alone and combination of drug A and drug B on HepG2 cells with MTT assay, suggesting that A and B have a maximal combinational effect at the dose of A 6 umol/L and B 1
8、00 umol/L ,respectively. Western Blotting analysis indicates that pro-apoptosis proteins include BAX and FADD are increasing and anti-apoptosis protein BCL-2 is reducing.Keyword Combination, apoptosis, the mechanism of action第一章绪论1.1细胞凋亡细胞凋亡定义、意义、形态学特征、作用通路、机理1.2立题依据先介绍下肿瘤的危害，再介绍下肝癌HCC (hepatic cell
9、 carcinoma)的危害。虽然有些临床治疗药物具有一定的疗效，但同时也会加重肝脏的损害。因此治疗肝癌药 物与保肝药物合用起到减毒增效的作用对肝癌患者具有极其重要的临床意义。药物A是一种独特的多靶点抗肿瘤药物，既抑制肿瘤细胞增殖又抑制了肿瘤血管的形成， 从而抑制肿瘤的转移。DrugA属于多酶抑制剂，能抑制RAF-1、BRAF丝氨酸/氨酸激酶的活 性，以及血管皮生长因子(VEGF-2、VEGF-3)、血小板衍化生长因子(PDGF)、受体酪氨酸 激酶KIT、FMS样酪氨酸激酶-3(FLT-3)等多种受体的酪氨酸激酶活性。Drug A具有抑制肿 瘤细胞增殖和血管形成的双重作用，即它一方面可以抑制受
10、体酪氨酸激酶KIT和FLT-3以及 RAF/MEK/ ERK途径中丝氨酸/氨酸激酶，抑制肿瘤细胞增生；另一方面它可以通过上游抑 制受体酪氨酸激酶VEGFR和PDGFR,及下游抑RAF/MEK/ ERK途径中丝氨酸/氨酸激酶，抑制 肿瘤新生血管的形成和切断肿瘤细胞的营养供应而达到遏制肿瘤生长的目。因此它可以起到 抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤细胞增值的双重作用。但在治疗的同时，药物A也会使患者的转 氨酶短暂性升高（22%）、酯酶增加等，因此能加重对肝肾功能的损害。药物B能够抑制肿瘤受体型酪氨酸激酶 （receptor t yrosine kinase, RTK）的活性，包括 表皮生长因子受体1（epi
11、dermal growth factor receptor 1, EGFR）和胰岛素样生长因子 1 受体 （insulin-like growth fact or 1 receptor , IGF-1R）及其下游信号分子的活化。 此外，药物B可以选择性清除羟自由基（OH）,且对NF-kB有明显的抑制作用。研究表明， 药物B有明显的保护和稳定肝细胞的作用，用于治疗急慢性肝炎、肝硬化、肝中毒等病。对 肝炎患者症状、肝功能均有明显的改善。在临床上的应用为对肝脏的保护作用。临床试用表 明该药作用强，疗效显著。第二章实验部分2.1实验材料一、细胞人肝癌 HepG2 细胞购于 American Type
12、Culture Collection （ATCC， Rockville， MD， USA）。接种在含10%胎牛血清、2%谷氨酰胺的1640培养液中，在37笆，5%CO2培养箱中培 养。二、药品及试剂Drug A、Drug B于无菌条件下，DMSO溶解后，用1640培养液稀释至所需浓度。1640培养基，美国Gibco公司（Grand Island， NY，USA）；胎牛血清，购于元亨圣马生物 技术研究所；胰蛋白酶、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、Hepes、二甲基亚砜（DMSO）、甲基噻 唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI）、丹磺酰戊二胺（monodansyl cadaverine，MDC）、RNase、
13、Protein K、琼脂糖、溟酚蓝、二氨基联苯胺和ECL试剂盒购于美国Sigma公司。抗p-ERK、ERK和B-actin的抗体，及辣根过氧化酶标记的二抗，购于美国Santa Cruz Biotechnology 公司（Santa Cruz, CA, USA）。三、仪器二氧化碳培养箱(NuAir, Plymouth, MA, USA)，酶联免疫分析仪(Tecan, Salzburg, Austria) , 6 孔、24 孔与96 孔培养板(Nunc, Roskilde, Denmark)，倒置相差显微镜(Leica, Bensheim, Germany)，荧光显微镜(Olympus，Tokyo
14、, Japan)，流式细胞分析仪(Becton Dickinson FACScan, Franklin lakes, NJ，USA), DYY-2 型稳压稳流电泳仪，DYY-III28A 型蛋白质电泳仪，DYY-III40B电泳槽(六一仪器厂)。2.2实验方法一、不同浓度的Drug A和Drug B单独处理HepG2细胞及Drug A和Drug B联合用药处理HepG2 细胞死亡的影响四甲基偶氮唑 3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT 是一种能接受氢原子的染料。可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀
15、酸脱氢酶和细 胞色素c的作用下tetrazoliu环开裂，生成蓝紫色的结晶甲臜(formazan)，甲臜结晶的生成 量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。用DMSO溶解甲 臜后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。取HepG2细胞，密度为6X103个/孔，接种于96孔培养板中，培养24 h后加入不同浓度 的Drug A和Drug B及Drug A、Drug B联合用药培养24 h后，加入不同浓度Drug A作用 6h、12h、24h、36h、48 h以MTT法测定细胞死亡率。按下列公式计算：死亡率(%)=A492 (阴性对照)一A492
16、(加药组)/ A492 (阴性对照)X100二、细胞形态的观察细胞凋亡的形态改变是多阶段的，其显著特征表现为：首先是细胞膜突起、细胞体积缩 小；接着部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落； 最后被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬。凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸外翻; 细胞核染色质浓缩、边缘化、DNA发生有序裂解，形成180-200 bp的整数倍片断。取对数生长期的HepG2细胞，密度为6X103个/孔，接种于96孔培养板中，培养24 h后，加入 不同浓度Drug入作用24h,在倒置相差显微镜观察细胞形态。三、细胞荧光染色的观察吖啶橙(AO)能够将凋亡细胞核或细胞质染色成可见致密浓染的黄绿色，在380 nm激发 光下发出黄绿色亮光。以每孔2X
