简单测定种子的生活力

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1、8 种 子 生 活 力 测 定Z1 概述种子生活力（Seed viability）是指种子发芽的潜在能力。种子生活力测定在农业生产上具 有重要的意义：测定休眠种子的生活力。许多植物种子因存在休眠，暂时不能萌发，因此 发芽率很低，尤其是新收获的和野生性较强的种子，必须进行生活力测定，才能了解种子的 发芽潜力，以便合理利用种子。播种前对发芽率低而生活力高的种子，应进行适当处理。种 子检验时，若发芽试验末期有新鲜不发芽种子或硬实种子，也应接着进行生活力测定，以正 确评定种子品质。快速预测种子的发芽力。休眠种子可借助于各种处理措施打破休眠，然 后进行发芽试验，但所需时间较长。而种子贸易中，有时因时间紧

2、迫，不可能采用标准发芽 试验来测定发芽力，因为发芽试验所需时间更长，如小麦需8d，水稻需14d，某些蔬菜和 牧草种子需23周，而多数林木种子则需要更长的时间。在这种情况下，可用生物化学速 测法测定种子生活力作为参考。种子生活力测定方法有10多种，根据其测定原理可大致分为4类：生物化学法，如四唑 测定法、溴麝香草酚蓝法、甲烯蓝法、中性红法和二硝基苯法等。组织化学法，如靛蓝染 色法、红墨水染色法和软x射线造影法等。荧光分析法。离体胚测定法。本节主要介 绍四唑测定法、离体胚测定法、染料染色法和软x射线造影法。Z2生活力测定方法一、测定原理有生活力的种子，其活细胞原生质膜具有选择透性，当种子浸入染料后

3、，染料大分子不 能进入活细胞内，所以胚部等活组织不能被染料染色，而死的种胚细胞因原生质膜丧失选择 吸收能力，故可被染料染色。二、测定方法（一）染色法1. 靛蓝染色法此法适用于豆类、谷类、棉花、瓜类和林木等大粒种子的生活力测定。所用试剂为靛蓝 （或称靛蓝洋红），分子式为C18H8O2N2 （SO5Na） 2,系蓝色粉剂，能缓慢溶于水。测定 方法如下：（I）种子预处理：将种子浸人30C水中，水稻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等种子须先 去壳再浸种，浸种时间因种子不同而异，小麦、大麦、大豆、豌豆和向日葵等为3h,燕麦、 芝麻等4h,油菜、花生、棉籽等6 h，蓖麻、红麻、大麻等7 h、黍8 h、水稻12

4、h、 玉米20 h将充分吸胀的种子（100粒2次重复），沿胚中线纵切（如禾谷类）或剥去种皮 （如双子叶种子），以备染色用。(2) 靛蓝染色：将处理好的种子置于培养皿或小烧杯内，加入靛蓝溶液淹没种子，纵切 种子，用0.1%溶液，剥去种皮种子用0.2%溶液。染色时间禾谷类为15min,油菜、芝 麻、红麻和大麻等30 min,大豆、亚麻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等60 min豌豆18 0 min3)观察鉴定：取出染色后的种子，用清水冲洗后立即进行观察鉴定。凡种胚不染色或染成浅蓝色的、胚根尖端或少部分子叶染色的，为有生活力种子；凡种胚全部染成蓝色的， 或胚根、胚轴、胚芽、子叶等大部分染成蓝色的，为无生

5、活力种子。2. 红墨水染色法其测定原理、种子预处理方法以及染色时间等与靛蓝染色法基本相同，只是所染成的颜 色不同，死胚染成红色，活种子胚不染色。测定时用刚开瓶的红墨水，加水稀释后使用，红 墨水与水的比例：小麦、玉米、大豆和棉花等为1： 60,大麦以1： 120为宜。到达规定 染色时间后取出种子，用清水冲洗并立即观察鉴定。(二) 其他方法四唑测定法(一)四唑测定法概述1. 发展简史四唑测定法于1942年由德国H.Lakon教授发明，二战期间传入美国。1ST A于1950年成立四唑测定技术委员会，1953年首次将四唑测定列入国际种子检验规程。1974年， ISTA四唑测定技术委员会主席美国，为发展

6、和推进四唑测定技术的标准化，主持编写四 唑测定手册，其后经过多次ISTA会议讨论修改，于I984年正式公布发行。该手册汇集 了世界上最先进实用的种子四唑测定技术，以及650多个属和种的农作物、蔬菜、林木、 牧草、药材和花卉种子的具体测定技术，堪称最具权威性的四唑测定参考。种子生活力四唑 测定技术经过不断研究和完善，目前已在全世界广泛应用。2. 特点四唑测定具有原理可靠、简便快速、结果准确、不受休眠限制以及成本低廉等特点。该 法比按细胞膜选择透比不同的染色方法更为可靠，所击仪器设备和物品较少，程序比较简单， 一般 2 4 h 之内即能获得测定结果，不论是休眠种子还是非休眠种子均适用。因此，该法

7、是世界公认的最有效的种子生活力测定方法。3适用范围根据国际种子检验规程规定，四唑测定适用于下列范围：(1) 测定休眠种子、收获后需马上播种的种子以及发芽缓慢的种子的发芽潜力。(2) 测定发芽试验末期末发芽种子的生活力，特别是怀疑有休眠时。（3）测定种子收获或加工过程中的种子损伤（如热伤、机械损伤、化学伤害等）原因。4）解决发芽试验中遇到的问题，查明不正常幼苗产生的原因和杀菌剂、种子包衣等处理的伤害。（5）查明种子贮藏期间劣变衰老程度，按染色图形分级，评定种子活力水平。（6）调种时时间紧迫，快速测定种子生活力。（二）四唑测定法的原理有生活力的种子活细胞在呼吸过程中都会发生氧化还原反应。四唑溶液作

8、为一种无色的 指示剂，被种子活组织吸收后，参与活细胞的还原反应，从脱氢酶接受氢离子，在活细胞里 产生红色、稳定、不扩散、不溶于水的三苯基甲替。化学反应式如下：依据四唑染成的颜色和部位，即可区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。一 般来说，单子叶植物种子的胚和糊粉层、双子叶植物种子的胚和部分双子叶植物的胚乳、裸 子植物种子的胚和配子体等属于活组织，含有脱氢酶，四唑渗入后能染成红色，而种皮和禾 谷类胚乳等为死组织，不能染色。除完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子 外，还可能出现一些部分染色的种子。判断种子有无生活力，主要看胚和（或）胚乳（或配 子体）不染色坏死组织的部位及面积大小

9、，而不一定在于颜色的深浅，颜色的差异主要是将 健全的、衰弱的和死亡的组织区别出来，根据上述原理.鉴定种子胚的死亡部分，还可以查 明种子死亡的原因。四唑染色是一酶促反应.因此反应不仅受酶活性的影响，还受底物浓度、反应温度、p H等因素的影响。该酶促反应的适宜pH为6. 17,高于者低于此pH反应不能正常进行， 也就无法测定种子活力的高低。因此.对于游离酸含量高的四唑试剂应当用缓冲液配制。反 应速率随温度的不同而变化.温度每升高10C反应速率提高1倍，譬如20C时需要反应 时间4h,30C则需要2 h,但反应最高温度不能超过45C，染色时底物的浓度要一致，一般染色部位切开的种子，测定时四唑溶液的质

10、量浓度为0.1%0.2%，染色部位完整的 种子，质量浓度为1%2%。种子预措时.采用的方法应根据种子的化学组成和种子结构 确定。（三）四唑测定法应用的化学试剂1 四唑四盐类有多种，最常用的是2,3,5一氯化（或溴化）三苯基四氮唑，英文名为2 ,3 ,5 - triphenyl tetralium chloride （or bromide） TTC（TTB）或 T乙分子式为 C 19H 15 N4CI，相对分子量334.8亦称红四唑，为白色或淡黄色粉剂，溶点243C，当达到约2 45C就会分解，易溶于水，有微毒，试剂在光下会被还原成粉红色，因此需用棕色瓶盛装， 且瓶外要裹一层黑纸。同样配好的四唑

11、溶液也应装入棕色瓶里，存放在暗处，种子染色也 需在暗处和弱光处进行。1996 版国际种子检验规程规定，正常使用四唑溶液质量浓度为10，但有些情 况下，可使用较低或较高的浓度。GB/T3543.7 1995规定，四唑染色通常使用质量浓 度为0.1%1.0%的四唑溶液，一般来说，切开胚的种子可用0. 10. 5%的四唑溶液； 整个胚、整粒种子或斜切、横切或穿刺的种子需用1. 0的四唑溶液。四唑溶液的pH要求在6.57.5范围之内，若溶液的pH不在此范围时，建议采用磷酸 缓冲液来配制。其配制方法为称取1 g四唑粉剂溶解于100 ml磷酸缓冲液中，即配成1. 0% (或0.1%)的四唑溶液。当用酸度计

12、测定时，若四唑溶液的pH达不到要求，则可用 NaOH或NaHCO3稀溶液加以调节。配好的四唑溶液应保存在棕色瓶中，一般有效期为几个月， 如存放在冰箱，则有效期更长。已用过的四唑溶液不能再用。2. 磷酸缓冲液为保证配制的四唑溶液pH在6.57.5范围内，通常采用磷酸缓冲液来溶解粉剂。磷 酸缓冲液的配制方法有两种，(1) ISTA规程法：先准备两种溶液。溶液I一一在1000ml蒸馏水中溶解9.078g KH2PO4。溶液一一在 1 000ml 蒸馏水中溶解 9.472 g Na2HPO4或 11.876 g Na2HPO42H2 O然后取溶液I 2份和溶液I I 3份混合即成。(2) AOSA规程

13、法：在 1000ml 蒸馏水中溶解 5.45 g N aH2PO4和 3.79 g Na2H PO4。3. 乳酸苯酚透明液用于染色后的小粒豆类和牧草种子，使种皮、稃壳或胚乳变得透明，以便清楚地观察鉴 定。其配法为：20ml乳酸+20ml苯酚+40ml甘油+20ml蒸馏水。4. 过氧化氢溶液用于某些牧草种子(如黑麦草、早熟禾、羊茅和鸭茅等)的预湿浸种，以加快吸胀和酶 的活化。一般应用0.3%H2O溶液。5. 杀菌剂和抗生素用微量的杀真菌剂和(或)抗生素加入四溶液或染色样品中，以延缓衰弱种子的劣变进 程。可应用 0.5%青毒素等抗生素6. 胶液硬化剂 有些种子浸种后，种皮表面出现胶黏物质而变得非常

14、光滑难以进行样品准备，可用AIK(SO4)212H2O, K2SO4,A12(SO4)3 等硬化剂处理。如将种子浸在 1%2%AIK(SO4) 212H2O溶液中5min,可有效地减少胶黏物质。(四) 四唑测定法的程序参照1996版国际种子检验规程的规定.介绍四测定法的程序：1. 试验样品从净度分析后并经充分混合的净种子中，随机数取100粒种子，4次重复。如果是测 定发芽试验末期休眠种子的生活力，则单用发芽试验末期所发现的休眠种子。2染色前的种子准备(1) 种子的预湿：预湿是四唑测定的必要步骤。因为吸胀种子一般比干种子不易破碎并 且比较容易切开或刺穿。此外，预湿使活组织酶系统活化，可提高染色的

15、均匀度、深度、鉴 定的可靠性和正确性。有些种子在预湿前还要进行预措处理，以利吸胀，如水稻种子需脱去 秤壳，豆科硬实种子需刺破种皮等，但须注意，预措不能损伤种子内部胚的主要构造。如果 利用较高或较低温度进行预湿，则相应调整预湿时间，并将所采用的时间和温度填报在种子 检验证书上。预湿方法有以下两种： 缓慢预湿：按发芽试验所用的方法，将种子放在纸上或纸间吸湿。该法适用于那些直 接浸在水中容易破裂和损伤的种子，以及已经劣变的种子或过分干燥的种子。有些种子，缓 慢预湿达不到充分吸胀，有必要进一步在水中浸一段时间。 水浸预湿：将种子完全浸在水中，让其达到充分吸胀。如果浸渍时间超过24h，则应 换水。部分植物种子在20r下的预湿方式和最少预湿时间见表5 一 I,表5 一 2。(2) 染色前的种子处理：许多植物的种类(表5 I,表5 一 2)在染色前需将其胚的主 要构造和活的营养组织暴露出来，以利于四唑溶液渗透便于正确鉴定。可采用下列处理技 术刺穿、切开种子或剥去种皮。其刺、切方法见图5 1。处理后的种子应保持湿润.直到 每个重复都完成为止。刺穿：对经过预湿的种子或硬实种子，可利用解剖针或解剖刀，刺穿种子的非主要部 位。纵切：所有禾谷类和禾本科牧草种子，像羊茅属大小种子或较大的种子，通过胚中轴 的中部纵向切开，约达胚乳长度的3/4；无胚乳而具有直立胚的双子叶植物种子，通过子叶略离中轴的一半纵切而