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1、硫化叶菌的假定蛋白质基因的PCR扩增生 122-1 刘昌陇 201270502101【前言】聚合酶链式反应简称PCR (Polymerase Chain Reaction)，是体外酶促合 成特异DNA片段的一种方法。PCR技术关键在于引物的设计，其目的就是为了找 到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的设计需要注意： 引物长度在18-35bp, G+C含量在40%-60%之间，内部无发卡结构； 引物之间避免形成二聚体； 引物3端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配； 在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片段，有时需要在引 物的3端加上适当的酶切位点。【目的】从
2、 NCBI 中获得 Sulfolobus solfataricus (12389bp)硫化叶菌的 16SrRNA 的序列，其中80709片段是编码保留待定蛋白的位置，使用软件Vector NTI Suite找出适宜的酶切位点，用特定的限制性酶切下，并电泳分离出该片段，选 出合适的引物，实现PCR的扩增以及对该蛋白的分析。【材料】种类名称界门纲目科属sulfolobus硫化叶菌古细 菌泉古菌 门热变 形菌 纲硫化叶菌目硫化 叶菌 科硫化叶菌属【工具】Vector NTI Suite是综合性蛋白核酸分析工具，具有蛋白核酸序列分析、引物 设计分析、序列显示等多种功能，本次报告利用其做引物的设计分析。
3、【方案设计】(1) 目的片段的酶切：使用软件VectorNTISuite找出适宜的酶切位点，用特定 的限制性酶切下；(2) 电泳分析：将获得的各酶切片段进行电泳，分析选择何种酶以能获得适宜 长度以及包含目的片段的酶)；(3) 按照要求找出合适的引物。4jjiT(3S7o；B耶占 3I (3370Sgp EE 13370)EE 13370)0=11(3370)Aqj yisT(3Z7O) SbEHCssTo)41(3370)AJlAJI 23Z7O)BbsL (11312：-I C11317)SbiilCSaoi眄石虹htS辭：【分析】1找出合适的酶切位点:将硫化叶菌的序列导入Vector NT
4、I Suite中，本次所需目的基因为序列的80-790 片段，通过软件找到合适的酶切位点，添加所有酶后所形成的酶切位点图如下：SstGZhsI CiMg=iJjniEICiosg/).L:TT (iLoia：s*ZI C11130)診 H jl Cl l lSD?Sis KU (11207)SiiPI C1L2OT：g J hi3u)SbiH (11312)L xi a 11(11317)我们需要的片段长度为80-709bp,由上图可知当用BrfBI酶切时，得到的片 段长为719,这样所得到的引物片段过短，显然不合适，因此考虑到所选的酶切 位点最好能够形成粘性末端，可得适宜的酶有AsuHPI(
5、l-791)、BstAPI(l-889)、 BstIZ316(1-980)等。2.电泳分离酶切产物选取能够使目的基因片段从所有的酶切产物中分离出来的酶，那么酶切产物中不 能存在和目的基因片段长度相近的片段。（1）选择BstAPI酶，选择琼脂糖凝胶电泳2h，能找到较好的片段，在1-889 之间，结果如下：日曰 General DescriptionConstant Field Electrophoresis in Agarose GelCuncentration: 1.0Voltage: 2.5 V/cmL已门gth M G 已I: 15 cmBuffer: TAESeparaticm Dist
6、ance: U.1 U cmTime Increment: 15.0 minAnimation Speed: 5.0 min/sec-J1. NONAME1 (7 fragments)range from 0.01 to 5.83 Kb- 5831- %tAF1 旧 19E11- 2499碼优IH菊%tAF1旧旳1 - en茁石旳1-B1246确化叶葡【tAPI总110 - %tAPIC3：3圧1-B1221碼菊【tAPI旧旳-%tAPI1卬1-|888-H695碼优菊%tAF1 旧 19E - %tAF1 旧旳 111 -_JB9碼优IH菊药印-%tAF1G：3茁 11(2)选择AsuHPI
7、酶，选择琼脂糖凝胶电泳4.7h,能找到较好的片段，在1-791 之间，结果如下：；已paration Distanc：已：0.10 cmTime Increment: 15.0 minAnimation Speed: 5.0 min/sec-一 NONAME1 (25 fragments)range from 0.02 to 2.61 Kb- 2G08-_J 2418【畑uHPIG54：3-畑uHPI159E1l-_J 1375晞优IH繭guHPI旺亦-guHPIIMMM-_J B9GG晞优IH繭加:uHPiri1424-endnZ389l-_J 790-_J BG20碼优叶葡址uHPI814
8、9-如uHPI87E9-_J 594晞优IH繭guHPI旧9D4 -guHPI19498l-_J B410-_J 381晞优 IH繭 JAiuHHnLLAiuHHWl+ _J 287+ _| 284+ _| 220+ _| B211+ _|B191+ _J175+ _J144+ _J1383.根据酶切产物设计引物按照下图的要求设计引物：PCR An alysis#1: Product of len gth 727 (rat ing: 144)Contains region of the molecule from 80 to 806Tm: 70.9 C TaOpt: 39.8 C GC: 29
9、.2Sense Primer:GTGAGAAAACAACTSimilarity: 100.0%Length: 14 Tm: 19.8 C GC: 35.7dH: -94.3 kcal/mol dS: -253.1 cal/mol dG: -17.1 kcal/molAntisense Primer:GTTCGGTGATTASimilarity: 100.0%Length: 12 Tm: 16.7 C GC: 41.7dH: -85.7 kcal/mol dS: -228.5 cal/mol dG: -15.8 kcal/molTm Difference: 3.1GC Difference: 6
10、.0#2: Product of le ngth 727 (rati ng: 135)Contains region of the molecule from 80 to 806Tm: 70.9 C TaOpt: 39.8 C GC: 29.2Sense Primer:GTGAGAAAACAACTCSimilarity: 100.0%Length: 15 Tm: 24.1 C GC: 40.0dH: -99.9 kcal/mol dS: -266.6 cal/mol dG: -18.6 kcal/molAntisense Primer:GTTCGGTGATTASimilarity: 100.0
11、%Length: 12 Tm: 16.7 C GC: 41.7dH: -85.7 kcal/mol dS: -228.5 cal/mol dG: -15.8 kcal/molTm Difference: 7.5GC Difference: 1.7#3: Product of len gth 727 (rat ing: 135)Contains region of the molecule from 80 to 806 Tm: 70.9 C TaOpt: 39.8 C GC: 29.2Sense Primer:GTGAGAAAACAACTCTCSimilarity: 100.0%Length:
12、17 Tm: 31.2 C GC: 41.2dH: -113.3 kcal/mol dS: -300.9 cal/mol dG: -21.8 kcal/molAntisense Primer:GTTCGGTGATTASimilarity: 100.0%Length: 12 Tm: 16.7 C GC: 41.7dH: -85.7 kcal/mol dS: -228.5 cal/mol dG: -15.8 kcal/molTm Difference: 14.5GC Difference: 0.5共输出三对引物，分别如下：l.Sense Primer: GTGAGAAAACAACTAntisens
13、e Primer:GTTCGGTGATTA2.Sense Primer: GTGAGAAAACAACTCAntisense Primer: GTTCGGTGATTA3.Sense Primer: GTGAGAAAACAACTCTCAntisense Primer: GTTCGGTGATT结果分析：(1) 长度：长度均为727,引物的长度对应Sense Primer依次为14bp、15bp、17bp, Anti sense Primer 的依次为 12bp。(2) TM：有效引物为55-80，三者都为70.9C，因此符合。上游引物的TM值依次为19.8 C、24.1C、31.2C； 下游引物TM
14、值均为16.7 C；TM的区别：分别为3.1，7.5，14.5，一号差值为3.1，其最小。GC含量：1、GC： 29.2上游引物GC： 35.7反义引物：GC： 41.72、GC： 29.2 上游引物：GC： 40.0 反义引物：GC： 41.73、GC： 29.2上游引物GC： 41.2反义引物GC： 41.7G+C含量一般为40%-60%.(4) 碱基分布：三者碱基分布都随机，两条引物间没有超过四个互补碱基都符 合引物条件。(5) 引物末端：引物引物的3端和引物的5端也符合条件。(6) 再进一步进行分析，发现一号的上游引物和下游引物均没有二聚体和发卡 结构，而二号和三号的上游引物都有二聚体和发卡结构，下游引物均没有，如下 图：(1)上游引物:(2)下游引物:【总结】(1) 根据Vector NTI Suite软件找到合适的酶切位点，选择BstAPI酶，并将其 做琼脂糖凝胶电泳2h,能找到较好的片段(1-889)；(2) 做引物的设计，发现一号上游引物和下游引物均没有二聚体和发卡结构， 而且GC含量相对高，TM的差值也是最小，其最适合做引物，因此我们可以选择 一号引物来进行PCR扩增，进而对所选蛋白进行分析。
