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1、植物细胞培养生产紫草宁紫草是一种重要的药用植物，其根部富含红色的萘醌类次生代谢产物-紫草宁 及其衍生物。它们具抗、消炎、活血、诱导癌细胞凋亡和抑制1型HIV病毒等功 效，同时也是一种天然的染料。紫草细胞中对羟基苯甲酸和焦磷酸香叶酯由羟基 苯甲酸香叶基转移酶催化生成香叶基-对羟基苯甲酸，后经一系列反应在内质网 中形成紫草宁，并通过胞外分泌作用将形成的紫草宁微粒运输到原生质体外的细 胞壁中。IDHHQ晶OHhDH?p On dsnxyt9l#.0NliH暂tirwi刺 rfiplijosphie1uh X l-geifsMbyi=4= hdi*LKphiei 吐 eOH X QivrajiylhY
2、iJruquiiiuiiaSigw fJADPIIUtrajiUlhMdruQUiiFU 门曹1.14 I3.11G4Hh y ift omn 忑斶 eKiyHranfeifitst 卩上J: LEHPGir-24-ii 7 dFox q最 t a ?a*teycfaimKfsuiiferD (La)； LeHFKST-H2.5 I S3目前已成功建立新疆紫早(Arnebia euchroma)、滇紫早(Onosma pan iculatum) 和硬紫草(Lithospermum erythrorhizon)的细胞培养体系，可以大规模工业生产 紫早宁。实践证明不同的培养、提取条件对紫早宁的产量
3、影响很大，对于影响紫 草宁生产产量的因素的研究有助于我们不断优化培养条件，提升紫草宁生产水平1. 培养基紫草细胞合成紫草宁的影响1.1 pH 值对紫草细胞合成紫草宁的影响方德秋等人1研究了 pH值对新疆紫草悬浮培养细胞生长及紫草宁衍 生物合成的影响。发现在pH=5.0-6.2范围内，新疆紫草细胞生长旺盛， 尤以pH5.6为最。而且在一定的pH范围内，生产培养基的初始pH值对 悬浮培养细胞中紫草宁衍生物含量的影响不大。1.2 激素对紫草细胞合成紫草宁的影响方德秋等人1也发现细胞分裂素类对紫草宁衍生物的合成有抑制作用, 且这种作用随使用浓度的增加而加强，但是一定浓度的细胞分裂素对细 胞的生长有促进
4、作用，因而有一个最适添加量。NAA和IBA会明显的抑制 紫草宁的合成，低浓度的IAA既能促进细胞生长又有利于紫草宁的合成。1.3 Ca2+/CaM 对紫草细胞合成紫草宁的影响刘志2等人研究发现 Ca2+/CaM 信号分子可能参与了对滇紫草细胞中 紫草宁形成的调控，对紫草宁的产量有十分显著的影响。合适的钙源浓 度能够促进紫草宁的生成。1.4 添加前体物质对紫草细胞合成紫草宁的影响胡立勇3研究了不同配方的培养基对紫草宁产量的影响，发现培养基 中添加L-苯丙氨酸（合成紫草宁的前体物质）对紫草素形成有明显刺激 作用。2. 光照对紫草细胞合成紫草宁的影响刘志2等人同样发现蓝光比较强烈地抑制紫草培养细胞中
5、紫草宁的形 成，而红光和绿光几乎没有影响。3. 培养方法对紫草细胞合成紫草宁的影响3.1 细胞悬浮培养：紫草细胞悬浮培养的研究已经比较全面了，该过程主要分两步。第一步，细胞的生长培养；第二步，合成色素的生产培养。细胞生长 动态为：接种后03d为延迟期，312d为对数生长期，1215d进 入静止期。细胞转入生产培养基以后的025d内，色素含量增加， 其中 1525d 为合成的高峰期.3.2 双液相培养紫草细胞培养生产紫草宁时, 培养基中过高的紫草宁浓度会对细 胞的紫草宁合成产生抑制。双液相培养在液体培养基中添加有机相， 及时移走水相中的紫草宁，避免了产物抑制作用；且在培养的同时实 现了产物分离，
6、减少了操作环节。3.3 固定化培养近些年，通过固定化细胞培养的方法生产次生代谢物的研究也越 来越多.固定化细胞培养加强了细胞之间的接触，有利于细胞进行次 生代谢，从而提高产量；同时，固定化有可能使细胞保持休止状态，可 以解决植物细胞在悬浮培养中容易变异的问题用于植物细胞领域的 固定化方法有凝胶包埋、吸附、泡沫固定及应用膜反应器等凝胶包 埋法因固定条件温和而广泛得到应用但凝胶作为固定化材料具有较 大的传质阻力，即使在最为常用的海藻酸钙包埋法中，也存在由于培 养基中的磷酸根结合Ca2生成沉淀而对凝胶造成一定破坏的问题.与 包埋法相比，吸附法具有操作简单，细胞活性能保持最高水平的特点, 因此具有极大
7、的应用前景。4. 生物反应器对紫草细胞合成紫草宁的影响生物反应器的选择对植物细胞的培养很重要，合适的生物反应器既使 得细胞、氧气、培养基浓度搅拌得均匀，又不会对细胞产生太大的影响。 由于搅拌式反应器会造成剪切力损伤，鼓泡式生物反应器面对高密度及 粘度大的培养物捉襟见肘，工艺研究者们一般都偏爱气升式生物反应器。 到目前为止，已经有很多利用气升式生物反应器扩大培养紫草细胞的报 道：10L气升环流式反应器大规模培养紫草细胞、5L外循环气升式反应器培养新疆紫草细胞、30立升气升 式生物反应器大量培养新疆紫草细 胞生产紫草宁目前规模最大的要 属中科院开发的气升内错流生物反 应器，规模达到150立升的中试
8、， 紫草宁的含量达到15%细胞干重。ALICR0F(Air Lift InternalGross Flow )气升内错流式生物反应 器的发明，始于对植物细胞培养特性的考虑。同微生物培养相比，植物细胞承受剪切力差，培养周期长，培养条件苛刻，易污染。而传统气升式反应器强调了反应器高度，在长提升管中 导致气泡聚合、长大、并在液面爆破产生对细胞的破坏力。为此，发明了径 向错流、高径比小、一器多用、结构简单、放大容易的ALICROF生物反应器。 该反应器除具有传统气升式反应器的优点外，气升错流生物反应器图示4尚具有以下特性：1适应植物细胞培养周期长，培养基随培养时间而蒸发减少的慢生物反应过 程。2抑制气
9、泡聚合长大，消除气泡在液面爆破产生冲击力对细胞的损伤。 3采用新型气体分布器和提升管，该两个部件的协同作用，改善了细胞循环 流动质量，消除了降液区匮氧现象，强化了混合与传递速率，大大降低了反应器 高度。4适用于粒径分布宽的细胞团块，反应器内无细胞堆积和滞留死区。 5在反应器内可进行过滤、洗涤、换液等操作，一器多用，适应植物细胞二 步法培养操作。此外，影响紫草宁产率的因素还有萃取条件等，最近有学者通过溶剂萃取、 超声波提取等方法大大提高了紫草宁的产量。相信，随着科学的发展，任何对人 类有益的物质都可以通过“生物反应器”大规模生产，给人们带来美好健康的生 活品质。参考文献1. 方德秋等.pH值、激素对新疆紫草悬浮培养细胞生长及紫草宁衍生物合成的影响.武汉植物学研究（1994）Vol.12 No.2：159-164.2. 刘志、戚金亮、杨永华Ca2+/CaM和不同波长的光对滇紫草培养细胞中紫草宁 的形成及其相关代谢基因表达的影响. 来源不明.3. 胡立勇.紫草细胞培养生产紫草素的研究.中药材（2004） Vol.27No.5:313-314.4. 气升错流生物反应器图示引自中华人民共和国专利局发明专利申请公开说明书，公开号CN 1175635A.
