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1、鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。2实验内容或原理 某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。3需用的仪器或试剂等动物 健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、
2、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备抗原：一般以鸡新城疫系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。0.7细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采
3、血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4冰箱内可保存两周。红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。再用离心机3000转分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内(微量
4、法可用孔径2-3毫米塑料管由翅静脉采血)，在室温中静置或离心，待血清析出后使用。每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。稀释液：为灭菌的生理盐水。红细胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠(SHOO)0.80克，柠檬酸(2H20)0.055克，氯化钠0.42克，蒸馏水加至100毫升。过滤分装，高压灭菌10分钟，放4冰箱保存。(2)红细胞凝集试验(HA) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。鸡新城疫病毒的HA试验与HI试验现采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替试管。首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴(0.05毫升)。用微量移液器取病毒抗原0.
5、05毫升，加入第一孔，反复抽动6次后，吸出0.05毫升加入第二孔，在第二孔反复抽动6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此连续稀释至第十一孔后吸出0.05毫升弃去。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。判断：沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。如上例：病毒液的HA效价以出现完全凝集的抗原最大稀释度为准。HI试验时，病毒抗原液为0.05毫升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成644=16倍的稀释液。孔号： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12滴度： 1:2 1:4
6、1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:517 1:1024 1:2048 对照稀释液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25抗原(病毒) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 红细胞悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用时间与温度 轻轻振荡1-2min 静置30-60min结 果 + + + + + + + 注意：+为完全凝集 +为部分凝集 为不凝集(3)红细胞凝集抑制试验(HI试验)：新城疫病毒凝集红细胞的作用，能被特异性抗体抑制，因此，可用HI试验(简称血凝抑制
7、试验)测定鸡血清中的HI抗体效价(滴度)，并可用标准血清，作新分离病毒的鉴定与未知病毒的诊断。 微量法：具体操作如下：用移液器向每孔加0.05毫升稀释液，十一孔加0.1毫升。用移液器吸取被检血清(或高免卵黄抗体)0.05毫升注入第一孔，抽放6次后，吸出0.05毫升，注入第二孔，如此连续稀释至第10孔，并从第十孔吸出0.05毫升弃去，血清稀释倍数依次为1：21024，11孔和12孔空白。每孔再加入已标定好的四单位病毒液0.05毫升，第十一孔为红细胞对照孔，不加病毒液。置振荡器上振荡1-2分钟，放1822静置20分钟。每孔再加入0.7红细胞悬浮液0.05毫升，放振荡器上振荡l-2分钟，置18-22
8、，30-60分后判定结果。第十一孔为红细胞对照孔，第十二孔作为抗原对照孔。HI试验与结果孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12被检血清稀释倍数 红细胞 抗原1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 对照 对照稀释液被检血清25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃去稀释液标准阳性血清25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃去4单位病
9、毒25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用时间与温度振荡1-2min，静置20 min红细胞悬液25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用时间与温度振荡1-2min，静置30-60 min结果1 + + + + +结果2 + +结果观察：将反应板倾斜成45角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释
10、倍数或以2为底的对数(log2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：64或HI效价为6(log2)。第十一孔仅含稀释液和红细胞为不凝集对照孔，第十二孔含稀释液，病毒液和红细胞为凝集对照孔。结果分析如下： 一般认为鸡的免疫临界水平为1：8(成年)或1：16(雏鸡)，但随地区不同而有差异。鸡血清的HI抗体效价高于1：16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价在1：16以下，须马上进行新城疫疫苗接种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平，应再提高。鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价(1og2)的平均值表示的。 如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价为8的有3份样品，为7
11、的有5份样品，为6的有2份样品，它们的平均值为： 平均水平在4(log2)，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于0.10.5，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为2。鸡群接种新城疫疫苗后，经23周测血清中的HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。附注：采用HA试验对各生物药厂生产的新城疫疫苗产品有质量检测作用。采用HI试验对各厂家生产高免血清
12、及卵黄抗体有质量检测作用。实验二 兔有机磷中毒的诊断和治疗1、 本次实验的目的和要求掌握有机磷中毒的诊断要点熟悉有机磷中毒的简易检验方法。了解有机磷中毒的解毒原理和治疗措施。2实验内容或原理1.阿托品（Atropinum）抗胆碱药原理：通过阻止乙酰胆碱和受体的结合而产生抗胆碱作用。但有机磷中毒病畜对阿托品的耐受性较高，故需用常规剂量的2（牛）4（羊）倍。2.氯磷定（Pyraloximi Methyl-Chloriaum，PAM-CL或2-PAMCL）为胆碱酯酶复活剂。原理：能与磷酰化胆碱酯酶中的有机磷结合，使胆碱酯酶释放并恢复其水解乙酰胆碱的活性；还能直接与有机磷结合为无毒物质排出体外。3需用
13、的仪器或试剂等动物：有机磷中毒病例，或用试验动物（猪或兔）做人工病例复制。器材：测瞳尺、磁反应板、磁蒸发皿、乳钵、分液漏斗、分液漏斗架、离心机、培养皿、玻璃容器、量筒、棕色玻璃、玻棒、微量吸管、25ml滴管、注射器、针头、听诊器、体温计、定性滤纸、新华滤纸、试纸、纱布、脱脂棉、剪刀、解剖器械、载玻片、皮筯等。药物试剂：氯仿、氯化乙酰胆碱、溴麝香草酚蓝、无水乙醇、干燥马血消化、饱和溴水、0.4mol/L氢氧化钠液，二氯甲烷、酒石酸、苯、三氯醋酸、无水硫酸钠、弗罗里矽士、丙硐、石油醚、蒸馏水、注射用水、精制敌百虫、0.5%硫酸阿托品、氯磷定、解磷定、双复磷、碘酊棉、酒精棉等。4实验步骤一、诊断要点（一）流行病学调查（二）生前症状：主要为胆碱能神经受过量
