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1、液质联用检测鱼肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留量李莹莹，宋永青，赵 榕，牛晋阳，郭文萍【摘 要】 建立同时测定鱼肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的液质联用检测方法(HPLC-MS/MS)。样品采用碱性乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，电喷雾离子源正 负模式切换，多反 应监测(MRM)，内标法定量。检出限分别为氟苯 尼考 1pg/kg,氟苯尼考胺5pg/kg。低、中、高3水平的加标回收率在87.0% - 110.4%之间，相对标准偏差均小于 6.2%。该方法前处理简便快速，分 s 析速 度快，灵敏度高。期刊名称】食品科学年(卷),期】2010(031)012总页数】4关键词】氟苯尼考；氟苯尼考胺；液质法；鱼肉 氟
2、苯尼考又称氟甲砜霉素，是氯霉素的第三代产品，广泛用于猪、牛、鱼及禽 类等多种动物的感染性疾病的防治，具有抗菌谱广、抗菌活性强等良好的药理 学特性，特别是无潜在致再生障碍性贫血作用，相对比较安全 1-2。随着进一 步研究发现，氟苯尼考具有胚胎毒性，动物用药后还会出现厌食、腹泻等不良 反应。同时氟苯尼考在养殖中大量、不规范的使用也导致其在畜禽、水产品等 动物性食品中的残留，直接影响消费者身体健康，并导致耐药菌的产生 3-5。 氟苯尼考的代谢物非常复杂，但多以氟苯尼考胺形式存在，欧盟规定了动物源 性食品中的氟苯尼考的最高残留限量为100pg/kg,并以氟苯尼考及其代谢物 氟苯尼考胺作为检出物6。因而
3、需要建立高灵敏度、快速，并可同时测定氟苯 尼考和氟苯尼考胺的检测方法以适应市场的需求。 动物组织中氟苯尼考残留的检测方法相对成熟，已有很多报道 7-11，但关于同时测定氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的国内外报道较少，报道的方法主要有液 相色谱紫外法12、液相色谱荧光法13、气质法14-15、液质法16-17、胶 束动电色谱法等18。其中，液质方法前处理过程较为繁琐，固相萃取柱消耗 品费用较高。本研究建立同时测定鱼肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的液质方法，直接采用碱化 乙酸乙酯提取，同位素内标法定量。1 材料与方法1.1 材料与试剂氟苯尼考、氟苯尼考胺、D5-氯霉素标准品Dr. Ehrenstorfer公司
4、；储备液用 甲醇配制（4C储存）；甲醇（色谱纯）；氨水、乙酸乙酯、正己烷（均为分析纯）；水 为一级水。1.2 仪器与设备1200超高液相色谱仪-6410串联四级杆质谱（配有电喷雾离子源）Agilent公司； Ultra-Turrax T25均质器德国IKA公司；20PR-520离心机 日本Hitachi公司。1.3 方法1.3.1 样品制备称取2.0g样品置于50mL具塞聚四氟乙烯离心管中，加入内标液（D5-氯霉素）、 5g无水硫酸钠（视样品含水量来定）、15mL乙酸乙酯、0.3mL氨水，均质30s , 4000 r/min离心5min，上清液转移至梨形瓶。另取50mL具塞聚四氟乙烯离 心管，
5、加入15mL乙酸乙酯，0.3mL氨水，洗涤均质器刀头，洗涤液转移至第 个离心管，用玻棒搅动残渣，涡旋1min，离心，上清液合并至梨形瓶,45C 旋干，加入3.00mL水，涡旋1min，加入5mL正己烷涡旋30s，分层后弃去 上层正己烷，再加入5mL正己烷重复操作一次，水层过0.2pm滤膜后，待测。1.3.2色谱条件色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18(2.1mmx50mm,1.8pm);流动相：甲醇- 水(70:30, V/V);柱温：40C;进样量：10pL ;流速：0.2mL/min。1.3.3 质谱条件干燥气流量9.0L/min，干燥气温度350C,喷雾气压力35psi
6、 , MRM采集参数见表1。2 结果与分析2.1 前处理方法的选择氟苯尼考不易溶于水，需要用有机溶剂从样品基质提取。在已报道的生物样品 中，氟苯尼考的提取方法均采用乙酸乙酯 7-11。氟苯尼考胺的化学结构与氟 苯尼考相似，本实验前处理直接用碱化乙酸乙酯提取，对比了超声、振荡、均 质3 种提取方法，其中均质提取方法耗费时间短，回收率较高。均质时，洗涤 刀头的乙酸乙酯溶液可以作为第二次提取液，从而进一步减少目标物的损耗， 提高回收率。旋转蒸发后分别加水 1.00、3.00、5.00mL ,对于基质较为复杂的样品，1.00mL水溶解量有限，回收率较低。3.00mL和5.00mL回收率相近，因而选 择
7、3.00mL，可以降低氟苯尼考胺的检出限。标准溶液分别用水、空白基质配制，对于鱼肉样品从峰形、峰面积、标准曲线 比较来看，差别不大。因而实验中标准溶液可直接用水配制。2.2 色谱条件的优化 氟苯尼考胺是碱性化合物，在普通 C18 色谱柱上易脱尾，于是选择了 Zorbax Eclipse Plus C18 色谱柱，此柱是针对碱性化合物特别研制的色谱柱，保证了 氟苯尼考胺优异的峰形。本研究以甲醇-水为流动相进行色谱条件的优化，氟苯尼考是弱极性化合物，保 留较强，而氟苯尼考胺是极性化合物，保留较弱，不到 1min 出峰，因而选择 低流速0.2mL/min，延长保留时间。在实际测样时为了和杂质分开，经
8、反复实 验，甲醇-水体积比为70:30 ,分离度最好。样品运行时间建议至少5min，让 杂质全部流出，减少对下个样品的污染。2.3 质谱条件的优化氟苯尼考的质谱条件比较成熟，负模式电喷雾离子源(ESI -)，定性离子为m/z 336和m/z 185，定量离子为m/z 336。氟苯尼考胺为碱性样品含有一NH2，选择正模式电喷雾离子源(ESI+)，通过子 离子扫描，结合氟苯尼考胺化学结构分析，选取m/z 230、m/z 130作为定性 离子，m/z 230丰度值大，受杂质干扰小，被选做定量离子。图1为氟苯尼考、 氟苯尼考胺和D5-氯霉素结构图及可能断裂方式。由于氟苯尼考胺先于氟苯尼 考lmin出峰
9、，D5-氯霉素最后出峰，电喷雾离子源正模式可以直接切换成负 模式。在氟苯尼考胺出峰前，采用切换阀将色谱柱初始液中强极性成分切换到 废液阀，从而减少杂质对目标物的干扰。2.4 标准曲线氟苯尼考标准品质量浓度在0.545pg/L,氟苯尼考胺标准品质量浓度在2 50pg/L范围内，采用同位素内标法，分别以定量离子峰面积比值(氟苯尼考或 氟苯尼考胺定量离子峰面积与内标峰面积之比 )对质量浓度比值(氟苯尼考或氟 苯尼考胺质量浓度与内标质量浓度之比)作图，所得曲线方程分别为氟苯尼考：y 二 1.8927x - 0.0085(r 二 0.9999)，氟苯尼考胺：y 二 1.3849x + 0.1258 (r
10、 二 0.9997)。2.5 回收率与精密度在空白鱼肉中添加3个不同水平的混合标准溶液，静置15min，按照1.3节方 法进行回收率实验。同时，每个添加水平平行操作6次，计算精密度。图2为 混合标准总离子流图(TIC)，图3为加标样品TIC图。从表2可以看出，氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率在87.0%110.4%之间，RSD在1.3%6.2%之间。按三倍信噪比计算，氟苯尼考和氟苯尼考胺的检出 限分别为1pg/kg和5pg/kg。3结论 液相色谱串联质谱法由于高灵敏度，低检出限，准确定性等优点在食品安全检 测中发挥了越来越重要的作用。本方法简便快速、低检出限、高回收率、重复 性好，可以同时测定氟苯
11、尼考和氟苯尼考胺，满足大批量样品检测的要求。参考文献：1 STEFAN S, CORINNA K, AXEL C, et al. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicolJ. FEMS Microbiology Reviews, 2004, 28(5): 519-542.2 卢运站，祁克宗,朱良强.动物源性食品中氟苯尼考残留分析J.上海畜牧兽医 通讯, 2006(5): 44-46.3 PARK B K, LIM J H, KIM M S, et al. Pharmacokinetics
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