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1、唇腭裂的基因研究GENE RESEARCH OF CLEFT OF LIP AND PALATE吕宝辉, 黄洪章2000，第十卷第四期唇腭裂是一种常见的先天畸形,有家族性发病倾向,文献报道单纯腭裂患者(cleft palate only,CPO)有家族史的约10%20%,非综合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cle, NSCL/P)有家族史的约25%35%1,是为大家公认的一种多基因易感性疾病。由于唇腭裂的遗传模式并不符合孟德尔遗传模式,目前其遗传模式仍是个争论的话题,主要有两种,既多因素阈点模式以及近来提出的主要致病基因遗传模式24,
2、而且唇腭裂因不同人种、地区、性别以及有无阳性家族史其发病率是不同的,因此唇腭裂的可能致病因素非常复杂,其发病机制到目前为止仍未明确。唇腭裂的基因定位是目前唇腭裂研究的热点和难点,国外学者已做了大量的临床和实验研究筛选可能的易感性基因以及进行基因定位,研究较多的是伴发唇腭裂的各种综合征的基因定位,而且已经定位了多种伴发唇腭裂的综合征的基因,非综合征性唇腭裂的基因研究也已经广泛开展,而且随着研究的进一步深入,唇腭裂发病机制的明确已成为可能。本文主要就非综合征性的唇腭裂的基因研究进行综述。1 实验研究和动物模型1.1 筛选研究对象,采集实验标本,文献报道可采集血样本和组织样本(颊粘膜组织)进行实验研
3、究1,5,6。先提取样本的DNA,选择特定基因标记引物进行PCR扩增,然后检测PCR扩增产物。筛选出的可能的易感性基因包括TGF、TGF、BCL3、MSX1、DLX2、RARA基因等1,48。1.1.1 TGF等位基因 Maestri等证实D2s443标记TGF等位基因4与唇裂伴发腭裂(CLP)患者呈显著性相关。Lidral等证实TGF等位基因除与有阳性家族史的CL/P患者呈显著性相关以外,与CPO和CL/P患者的连锁不平衡无显著性意义。Wyszynski等证实染色体2q13上的D2s443标记TGF等位基因与NSCL/P呈非显著性相关。Shi-ang等在提取样本DNA进行PCR扩增后,分割扩
4、增产物为DNA片段,以TGF标记探针进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),证实TGF与CPO患者呈显著性相关,以及进行DNA片段的测序证实了TGF等位基因的突变部位。1.1.2 TGF3等位基因 Lidral等证实TGF3等位基因与CL/P患者的连锁不平衡统计分析结果有显著性意义,同时对TGF3等位基因进行突变部位查询,未发现普遍性突变,但在TGF3等位基因发现了可以改变基因正常功能的几种罕见突变。Maestri等证实D14s61标记TGF3等位基因6与CL/P患者和CPO患者呈显著性相关。1.1.3 BCL3等位基因 Maestri等证实BCL3标记BCL3等位基因3与CL/P患者和CP
5、O患者呈显著性相关,D19s178标记BCL3等位基因8和等位基因13与CLP患者呈显著性相关。Lidral等证实BCL3等位基因与CL/P患者和CPO患者的连锁不平衡的统计分析结果无显著性意义。1.1.4 MSX1等位基因 Lidral等证实MSX1等位基因与CL/P患者的连锁不平衡统计分析结果有显著性意义,同时对MSX1等位基因进行突变部位查询,未发现普遍性突变,但在MSX1等位基因上发现了可以改变基因正常功能的几种罕见突变。1.1.5 DXL2等位基因 Lidral等证实DXL2等位基因与CL/P患者的连锁不平衡统计分析结果无显著性意义,同时对DXL2等位基因进行突变部位查询,未发现有基
6、因突变。1.1.6 RARA等位基因 Maestri等证实THRA标记RARA等位基因8与CL/P患者呈显著性相关。另外,Beiraghis等研究一个五代家系证实染色体4q上的D4s175标记附近和D4s192标记附近有等位基因与NSCL/P呈显著性相关,该基因可能为NSCL/P的主要致病基因,而染色体6上无与NSCL/P相关的可能易感性基因。1.2 随着转基因技术和基因敲除技术的完善和发展,人们将外源性基因转移至动物体内,使之在特定组织和器官特异性表达,以及在发育过程中特定时间上表达以研究基因功能和基因表达在转录、转录后、翻译和翻译后等不同水平上的调控机制,而基于基因同组原理的基因打靶技术的
7、出现使基因敲除动物模型的建立成为可能,并使之在特定组织器官上表达而不影响其他组织器官。Sandgren等9和Jhappan等10的TGF过度表达转基因动物实验不支持TGF等位基因在唇腭裂形成中的作用。Um-bach等11的Sek4和Nuk基因的无效表达动物实验证实了Sek4和Nuk受体在面部发育中有重要作用并且互相协作共同影响面部的发育。Damm等12的转基因小鼠动物实验证实RA受体畸变抑制了转录过程,诱导形成转基因小鼠腭裂,影响面部发育,同时进一步研究了RA的基因表达调控机制。Condie等13的Gad67基因突变小鼠动物实验证实了Y-氨基丁酸(GABA)在小鼠腭正常发育中有重要作用。1.3
8、 另一种研究方法为体外培养实验研究,有腭细胞培养、腭器官培养和全胚胎培养。腭突中嵴上皮细胞(MEE)和腭间充质细胞(EPM)的研究多采用腭器官培养的手段14。Potchinsky等15的EPM细胞体外培养实验研究证实了有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)调节EGF对细胞的效应,证实了环腺苷酸(cAMP)和TGF信号转导通路调节EGF对细胞的增生作用,以及多条信号转导链调控EPM细胞的增生反应,MAPK不调控EGF对细胞的增生作用,可能调控EPM细胞的其他过程。Hehn等16的鹑卵全外培养实验提示MAPK在鹑的继发腭的形成中与细胞因子调控的细胞增生有关。Nugent等17通过EPM细胞体外培养实验
9、研究证实RA和RA诱导的TGF在腭细胞增生和葡萄胺聚糖(GAG)形成中的调控作用,提示TGF在RA诱导腭裂畸形的形成中有重要作用。2 基因与环境的交互作用 唇腭裂的致病因素包括基因因素和环境因素。而基因表达的调控可以在转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰各个水平上进行调控。环境条件影响基因效应,也是通过形成一定的细胞内外环境,通过受体和配体活性的改变,影响细胞的信号转导通路或直接形成基因突变来调控腭突的发育。家系分析已证实烟、酒与某些药物能显著增加个体唇腭裂畸形的发病风险。Maestri等5分层分析受累患者唇腭裂的类型、人种、家族史和母亲孕期吸烟与可能易感性基因的交互作用,证实阳性家族史与D2s
10、443标记TGF等位基因4的交互作用呈显著性相关;母亲孕期吸烟与D2s443标记TGF等位基因4的交互作用的统计值P=0.06,虽不呈显著性相关,但也有一定的意义;母亲孕期吸烟与D14s61标记TGF3等位基因6的交互作用呈显著性相关;以及高加索人群与D19s178标记BCL3等位基因13和THRA1标记RARA等位基因8的交互作用呈显著性相关。Hwang等18证实CL/P患者与CL/P阳性家族史呈显著性相关;CPO患者与CL/P或CPO阳性家族史以及其他家族性出生缺陷史呈显著性相关;母亲孕期吸烟与TGFTaqIc2等位基因交互作用呈显著性相关(其中分两组:阳性家族史患者和非阳性家族史患者);
11、同时TGFTaqIc2等位基因和母亲孕期吸烟的CPO患者呈显著性相关,而TGFTaqIc2与CPO患者(包括母亲孕期吸烟和孕期不吸烟的CPO患者)呈非显著性相关,提示TGF可能调节组织对环境影响的易感性。Lidral等1证实TGFTaqI等位基因与阳性家族史呈显著性相关,有无阳性家族史影响统计分析的结果。目前国内外广泛应用的化学药物诱导鼠腭裂模型是通过化学药物调控基因表达,以细胞因子、受体和信号转导通路的变化来调控腭突的发育,诱导腭裂的形成,也是基因与环境交互作用的体现。同时基因之间也相互作用,Maria等19的EGFR无效表达的基因敲除动物模型,证实在不同的基因背景下其表现型不同以及EGFR
12、调控细胞的增生和分化作用,但需要进一步研究EGFR在胚胎期唇腭裂形成中的作用。3 唇腭裂的遗传分析 主要用于唇腭裂的易感性基因的定位。目前用于唇腭裂的遗传分析方法主要有以下几种2023。3.1 连锁分析(linkage analyses):根据基因重组率来计算两基因之间的染色体图距称为连锁分析,其中有优势对数分数法(log odd score,lods)、受累同胞对法(affected sib-pair,ASP)、受累家系成员法(affected pedigree member,APM)都是两点连锁分析方法。1955年Morton利用似然性估计的原理提出了Lods法,主要检测在两基因以某一重组
13、率相连锁时,出现这种情况的似然性有多大,其优点是可利用两代小家系资料的分析,结果的判断也比较容易,缺点是亲代基因型必须已知,且其中必须有一个双重杂合子,不适合三代或三代以上大家系的分析,而且在这一方法中,疾病基因坐标之间的重组率是根据家系资料和疾病的遗传模式来计算的,此法在唇腭裂基因定位研究中的作用非常有限。ASP法其特点是不需要知道遗传病的遗传方式、基因频率和外显率,但在实践中需掌握亲代的等位基因类型。ASP法检测易感性基因座位的能力依赖于该座位对遗传性状改变作用的大小,此作用的大小可根据受累先证者的同胞的发病风险与群体发病风险法的比值来估计。ASP法的不足是在于为了排除遗传异质性的影响,需
14、要收集几百个受累同胞对,以及不能得出遗传标记和易感性基因之间的距离。ASP法还可用于排除侯选基因,如果两受累同胞都不具备双亲的某种基因类型,基本上可以排除此基因为易感性基因。APM法不需进行亲代等位基因类型的鉴定,也不考虑子代的基因是否来自同一亲代,仅检测某一家系中患病个体间(不必是同胞)的标记等位基因的相似性,其有效性较ASP法低,是对lods法的一个有效补充。两点连锁分析法的一个不足是处于杂合和纯合状态的两个紧密连锁标记在不同个体上有不同表现时难以分辨。3.2 连锁不平衡和关联研究:是基于群体中无亲源关系的病例组和表现正常的对照组在某个遗传标记位点上会出现不同的频率而设计的。通过两者频率的
15、不同就能推测所研究的某个遗传标记和某个易感性基因之间是否存在因果关系或连锁不平衡。建立在群体水平上利用连锁不平衡方法进行基因定位时,最好选用隔离群体以及以受累家庭为基础的内在对照组以排除混杂因素的影响。目前唇腭裂的遗传分析利用以上的几种方法,综合分析评价可能易感性基因与唇腭裂畸形的关系,来进行最终的精确定位。4 结语 唇腭裂是一种多基因易感性疾病,其发病机制仍不确切。目前CL/P与CPO发病机制的不同已为大家广泛接受,不同类型、不同程度的唇腭裂发病机制的不同需进一步深入研究。目前唇腭裂基因研究已筛选了几个可能的易感性基因,但对这几个可能的易感性基因不同的文献结论不大相同,有的甚至结论相互对立,
16、需要进一步分层受累患者,排除环境因素和遗传异质性的影响,进一步研究以筛选可能的易感性基因,然后对可能的易感性基因进一步查询突变部位,研究突变对基因表达的影响以及其他相关的研究。由于唇腭裂的致病因素非常复杂,环境与基因的交互作用和在不同的遗传背景下基因的表现型并不一样,进一步研究细胞因子、受体和信号转导通路在基因表达调控中的作用,是唇腭裂发病机制研究的关键,只有这样才能真正在细胞分子水平上明确唇腭裂的发病机制。同时由于唇腭裂的遗传分析方法各有优缺点,在实际工作中须做好实验研究的可行性分析、选择好合适的分析对象和样本的大小以及选择好恰当的遗传标记的数目和类型,当然这都需要做大量的工作,需要大量的资料包括大量的家系资料、选择基因组的有高度信息含量的遗传标志以及合适的处理多基因病的统计学方法等。总的说来随着科
