FISH说明书中文

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1、VYSIS说明书试验程序原理 21 黄 Y 黄 X 绿在原位杂交X绿光探针centromerregion是一种在一个细胞标本里能看见特定的核酸序列(尤其是DNA)的技术， (FISH) 包括精确的单股荧光标记DNA探针的退火 与目的基因互补. 探针荧光的DNA 位点能通过直接的检测用荧光显微镜看到。羊水标本包括间期细胞用标准的细胞遗传学方法附着在玻片上。样本标本DNA变性，然后与 CEP x/y and LSI 21 探针杂交。在杂交后，多余的和未结合的探针被一系列洗涤所除掉。 染色体和核DNA用特殊的染料被复染，复染剂 DAP发蓝光. 用装上适合的激动剂与发射滤器的荧光显微镜观察 CEP X

2、/Y 和 LSI 21 DNA 探针杂交，能看到强烈的橘黄光和绿色的荧光信号和蓝色的复染核。 通过显微镜检查 21 X, and Y染色体点计，荧光染色区域明亮地突出于核的DNA普通的蓝色荧光(通过DAPI复染) . FISH 程序能使核的 21,X,and Y染色体点计可见。CEP X/Y DNA 探针是一种绿光和橘黄光混合物，直接标记荧光的DNA探针，分别在X和Y染色体的DXZ1 和DYZ3 区。LSI 21 DNA 探针是一种橘黄色光直接标记的荧光DNA 探针，包含特异性 DNA 序列对应位于21号染色体21q22.13 到 21q22.2 区的D21S259 和D21S342 基因座.

3、所有探针混合物都在杂交缓冲液中经过了预变性以便于应用。本试验设计目的是用荧光原位杂交法探测和量化21,X,and Y染色体 。 试剂和仪器提供的材料本试剂盒包括四种试剂，够约20次测试。 成分组成容量 储藏LSI 21 DNA 探针:E.coli大肠杆菌质粒 (探针经过预变性 )橘黄光标记DNA 探针与阻断DNA 和杂交缓冲液预混合（右旋糖酐硫酸盐,甲酰胺， SSC）200ul/ 小瓶(10ng/ul)-20 避光CEP X/Y DNA 探针(探针经过预变性 )绿光荧光标记X探针和橘黄光标记Y 探针，与阻断DNA 和杂交缓冲液预混合 （右旋糖酐硫酸盐,甲酰胺，SSC）200ul/小瓶（15ng

4、/ul20避光DAPI II复染剂125ng/Ml DAPI在 苯二胺 二氢氯化物, ,甘油 和缓冲液中600ul/1小瓶-20避光NP-40去离子去污剂4ml/ 2小瓶20到2520x SSC氯化钠和柠檬酸钠66g/ 1包装同上探针对照玻片男性，羊水细胞（正常） 固定的生物标本 得自正常男性羊水细胞加于玻璃显微镜玻片 5 片(10靶区)20 干燥产前筛查阳性探针对照玻片。 固定的生物标本 得自人成纤维细胞系加于玻璃显微镜玻片5slides（10靶区）同上储存和处理储存未开封的试剂盒做为一个整体在 -20 避光，避湿 . 20 x SSC 应单独储存于室温。储存探针对照玻片在一个密封的容器中在

5、-20，应用干燥剂防潮. 每一个未开封的试剂盒成分的失效日期标于独立的标签上。这些储存条件适用于所有开封及未开封的组成部分。 需要但未提供的材料实验室试剂超纯甲酰胺储存于 +4 至多一个月（从收到起，具体看制造商的建议的详细信息）浓缩盐酸(12N) HCL1N 氢氧化钠纯净水(蒸馏或去离子的or Milli-Q). 储存于室温中carmoys 固定剂 (3:1 甲醇:醋酸)drierite干燥剂1x 胰蛋白酶 /EDTA (0.05% 胰蛋白酶,0.53Mm EDTA -4Na 于 Hanks 平衡盐溶液中without Cacl2,Mgcl2.6H2O and M gSO4-7H2O)0.5

6、6%氯化钾实验室器械荧光显微镜（装备建议的滤光器） 定相对照光学显微镜预先清洁的显微镜玻片玻片加温器(45 -50 ) 22mm x22mm玻璃盖玻片 (1-10ul)微升消毒枪头聚丙烯微离心管(0.5ml or 1.5ml) 定时器磁力搅拌器 涡流微离心机 量筒水浴(672 和731)空气孵化器恒温箱(37)菱形头划线器湿室 钳子（镊子）无菌注射器(5ml)Coplin 缸(6) 建议型号 :wheaton 产品.No.900620 垂直染缸PH 计和 PH 试纸校准的温度计金属试管架橡胶粘固剂0.45um 孔过滤器显微镜器材和滤光器显微镜 : 需要epi- 照明荧光显微镜观察荧光 ,应该检

7、查以确定正确操作一台显微镜判断适合的普通DNA 染色，如 DAPI propidium lodide, and 阿的平可能不适合FISH , 应该常规显微镜清洁和制造商的技术顾问做定期的调整。注意: 通常 ,推测的试剂失败在一次原位试验中可能实际为荧光显微镜功能失常或未达最佳标准或者是应用了不正确的滤光器设置去看一个成功的杂交试验。 激发光源: 激发灯是激发荧光团为荧光的光源. 除非激发灯正确排列，否则最适宜的图象不会产生。对于CEP and LSI探针100瓦的水银灯是建议的激发光源. 灯的建议最长使用时间是200小时。记录灯泡的使用小时数，在超过额定的小时数以前更换。 物镜: 物镜的选择在

8、亮度、分辨度、图象的综合质量上有很大的影响， 当使用100瓦的水银灯去看CEP 测定结果时，使用油浸荧光物镜和数字光圈0.75。一个40x物镜与10x目镜结合，适合浏览（细看）及常规的FISH分析。当需要高度扩大倍率时，63x或100x油浸achromat （色盲患者）型物镜能取得很好的效果。浸油：用于油浸目镜的浸油应该表明用于低自动荧光尤其用于荧光显微镜。 滤光器 多波段和单波段荧光显微镜滤光器，（最适于该试剂盒）可在公司购得。可用于大多数型号显微镜。CEP X/Y 和 LSI 21, 绿色和三波段 DAPI/Green/Orange 滤光器均可购于公司. 橘黄光信号将发粉橘色，绿光信号将发

9、黄绿色，所有其他DNA经DAPI染色将发蓝色荧光 。所用试剂的准备20x SSC制备PH 5.3的20x SSC66g 20Xssc200ml 纯净水共250ml彻底混合,在室温下用PH meter 测PH ,必要时用浓盐酸调整PH值到5.3,总容量在250ml,用0.45um 滤纸(filter) ,储存在有该容器中在室温下最多6个月.变性溶液70% 甲酰胺 in 2x SSC PH7.0-8.0,49ml 甲酰胺7ml 20X SSC PH5.314ml 纯净水总容量 70ml充分混匀,放在玻璃coplin 缸中,在室温下用带有玻璃PH电极的PH 计测PH确保PH 在7.0-8.0之间.在

10、2-8摄氏度储存在有盖容器内,在一周内使用.每次用前检查PH酒精洗涤溶液用100%酒精和纯净水,配制稀释液(v/v)70%,85%,100%三种浓度.储存在室温下盖紧.稀释溶液可于一周内使用,除非蒸发或者由于过度使用而稀释.注意:需要额外的试剂处理标本和玻片制备过程,详情参见特殊程序部分.0.4X SSC/0.3NP-40洗涤溶液950ml 纯净水20ml 20xSSC PH5.33ml NP-40总容量 1000 ml 彻底混匀，必要时用1N NaOH 调PH至7.0-7.5，用带有玻璃PH电极的PH 计测PH。用纯水调中容量到1升，用0.45um孔的过滤器过滤，储存未用的溶液在有盖容器内在

11、室温下可用6个月。每天结束试验后丢弃用过的溶液0.1NP-40 in 2x SSC100ml 20 SSC PH 5.3849ml 纯水1ml NP-40总容量1000ml彻底混匀，必要时用1N NaOH 调PH至7.0-7.5，用带有玻璃PH电极的PH 计测PH。用纯水调中容量到1升，用0.45um孔的过滤器过滤，加70ml到copplin 缸中保持在室温。存储未用的溶液在有盖容器内，室温下可用6个月，每天结束试验后丢弃用过的溶液。警告及注意事项1. 用于in vitro 诊断2. 探针对照玻片取自认培养羊水细胞已经被固定多次在75甲醇/25醋酸中。因为不可能知道哪一步被污染，所有人的标本和

12、对照玻片都应该小心处理， 标本处理原则可由美国疾病控制与预防中心获得。3. 由于使用vysis公司提供或建议以外的试剂。杂交条件可能被颠倒。4. 如果在玻片的变性，杂交，和信号点计过程不遵守所有的程序，可能引起不可接受的或者错误的结果。5. DAP2 复染剂包含DAPI 和 1，4苯二胺自由基DAPI 是一种诱变剂在positive genotoxic 效应的基础上，避免吸入，摄入或接触皮肤。1，4苯二胺 是一种皮肤和呼吸致敏物，避免吸入，摄入或接触皮肤。详情参见MSDS 。6. 暴露于光下，荧光团容易photobleached，为限制这种降解，在减弱的光下处理所有包含荧光团的溶液，包括处理玻

13、片杂交的所有步骤， 进行所有不需要光的操作步骤（保温阶段，洗涤等）在减弱的光下，避免直接的光照在荧光团上。详情参见MSDS7. 探针混合物包含甲酰胺，致畸物。避免接触皮肤和粘膜，详情参见MSDS8. 强烈建议用校准的温度计，测量溶液的温度，水浴，和恒温箱因为这对产品发挥最好的效能很重要9. 根据你单位关于有害物降解的原则降解所有有害材料 。标本采集，处理，储存，和玻片标本采集和处理由未经培养的羊水制备玻片标本 1 离心2-5ml 整个羊水（AF）样本，1000转5分钟。羊水样本不应该表现为血性或者褐色2. 在2-5ml 1x 胰蛋白酶/EDTA 中，混悬细胞团在37摄氏度水浴至少15分钟。3.

14、 离心悬液1000 转 5分钟4. 在2-5ml 0.56 氯化钾中混悬细胞团，37摄氏度水浴20分钟5.加0.8-2ml 固定液（3：1甲醇：冰醋酸）6.离心悬液1000转5分钟， 在1ml 新鲜的固定剂混悬细胞团。储存固定的标本在4摄氏度至少30分钟，或者直到进行FISH长期储存，在固定液中存放在-20摄氏度7在把细胞放在玻片上之前，调整细胞悬液的容量，根据细胞团的大小，必要时，尤其实储存了很长时间下（大于1个月），在制备玻片前用 固定液洗涤细胞团。8.制备FISH用的玻片，直接滴细胞悬液到1或2张冷的玻片上制作两个杂交区，（每个区15-20ul细胞团） 试验程序荧光原位杂交程序摘要标本D

15、NA变性1. 湿化杂交室（一个带一张湿吸墨纸的 密封容器 或者纸巾大约1*3英寸。贴在容器的侧壁），预热37度，通过把它放在37度恒温箱中 ，在玻片制备前2. 加变性溶液到coplin缸中，方在73加减1度水浴中至少30分钟，在使用前查看溶液温度3. 每次用前校验变性溶液的PH在7.0-8.0，通过把制备好的玻片浸在变性溶液中在73加减1度5分钟，使标本DNA变性，不要变性超过每次每缸4片玻片。4. 用钳子，从变性溶液中拿出玻片，立即放进70酒精洗涤溶液中，在室温。摇动玻片使除掉甲酰胺，允许玻片立在酒精洗液中1分钟5. 从70酒精中拿出玻片，用85和100酒精重复步骤46. drain 多余的酒精从玻片上，用玻片底边接触一个吸墨水纸用实验室wipe擦干底面7. 在准备好加探针溶液以前将玻片放在45-50度玻片加热装置，不超过2分钟，注意：如果在探