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1、实验一 牛乳中酪蛋白的提取及其含量测定一、实验目的1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。二、实验原理酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的8082%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙
2、醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。三、材料与试剂市售牛奶10mg/ml酪蛋白标准溶液（用0.1MNaOH配制）0.1M NaOH溶液、0.2M pH4.6的HAcNaAc缓冲液双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO45H2O）1.5g，加水100ml，加热助溶；另称取酒石酸
3、钾钠（NaKC4H4O64H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500ml水中。两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH 300ml，后用水稀释至1000ml，贮存于塑料瓶中。此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。四、操作步骤1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀用量筒量取25ml牛乳置50 ml 烧杯中，水浴加热至40，在搅拌下慢慢加入到已预热至40的等体积的0.2 M pH 4.6的HAcNaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min离心15 min，弃上清液，收集沉淀。2、除杂将上述沉淀捣碎，加入10 ml 95%乙醇，搅拌制成悬浮液。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除
4、去乙醇溶液，再用10ml乙醚乙醇混合液（11）洗涤沉淀两次，最后再用10 ml乙醚洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，称量（质量为m0）。称取挥干乙醚后的酪蛋白沉淀适量（质量为m1），置烘箱中80干燥过夜，称重（m2）。其余沉淀留作下步试验用。3、酪蛋白产品纯度测定（1）标准曲线的绘制分别移取酪蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于干燥试管中，不足1.0ml者用0.1M NaOH溶液补足1.0ml，然后分别加入4.0ml双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度。以酪蛋白质量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标
5、准曲线。（2）酪蛋白含量测定称取“2步骤”中留取的沉淀适量（m3），用0.1M NaOH溶液溶解，配成10mg/ml样品溶液（体积为V ml）。取该溶液1.0ml，加入4.0ml双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。平行测定3次，求其平均值（m4）。五、结果与讨论1、牛乳中酪蛋白含量的计算含量（g/ml）=2、酪蛋白产品纯度的计算酪蛋白纯度=六、思考题1、为什么在等电点沉淀时需加热至40？2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？为什么？3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？实验二 大蒜细胞SOD酶的提取与分离一、实验目的1、掌握SOD酶的提取
6、、分离、检测等一般步骤；2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数：回收率和纯化倍数。二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用PH7.8的磷酸缓冲液体提取。由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。颜色
7、深SOD逐渐增多颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。三、试剂和材料新鲜蒜瓣，市售磷酸缓冲液：0.05 mol/L，pH7.8氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿无水乙醇=35（V/V）丙酮：用前冷却至410 0.1mol/LTrisHCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）10mmol/L HCl45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）四、实验步骤1、组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎。2、SOD的提取将上述破碎的组织或细胞，加入 23倍体积（10-15 ml）的 0.05 mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶
8、解到缓冲液中，然后在5000 r/min下，离心 15 min，收集上清液得提取液。留出1ml备用，剩余提取液准确量取体积后进行下步实验。3、除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15 min，去杂蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。留出1ml备用，剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。4、SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于少量（5ml）0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液中，再加水5ml，5000r/min离心15min，收集上清液，得SOD酶液
9、。准确量取体积。将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力和蛋白浓度。5、SOD活力测定 参照李建武的生物化学实验原理和方法，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活力。邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和O2-自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化O2-自由基与+H结合生成02和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。中间产物在325nm时有强力的光吸收，采用分光光度计即可检测。（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：在试管中按表1加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325n
10、m波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算邻苯三酚自氧化速率k0（直线斜率）。表1 邻苯三酚自氧化测定加样表试 剂加 样 量 （ml）校零管测定管0.1mol/LTrisHCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）4.54.5蒸馏水4.44.410mmol/L HCl0.145mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）0.1总体积9.09.0（2）SOD酶活的测定：在试管中按表2加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一
11、次光吸光度，测至第5分钟。以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算加入SOD酶样品后的邻苯三酚自氧化速率k1（直线斜率）。表2 SOD酶活测定加样表试 剂加 样 量 （ml）校零管测定管0.1mol/LTrisHCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）4.54.5蒸馏水4.34.310mmol/L HCl0.1待测样0.10.145mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）0.1总体积9.09.0（3）酶活力测定酶活性单位定义为：在lml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。按下式计算样品中SOD酶单位活力：单位
12、体积活力（U/ml）= 总活力（U）= 式中：反应液总体积=9ml；样品液稀释倍数=1；加入样品液体积=0.1ml；活性单位定义体积=1ml；样品液总体积=实验中各样品实测体积。6、样品中可溶性蛋白含量的测定从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液中分别取0.2ml、0.4ml、0.5ml，按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍进行稀释，分别测定稀释液在260nm和280nm波长处的吸光值，按下式计算可溶性蛋白的含量：蛋白质浓度 (mg/ml) = (1.45A280 0.74A260) 稀释倍数总蛋白（mg）= 蛋白质浓度样品液总体积五、结果与讨论 将试验结果及相应的计算结果填入下表：体积（m
13、l）单位活力（U/ml）总活力（U）蛋白浓度（mg/ml）总蛋白（mg）比活力（U/mg）回收率（%）纯化倍数提取液1001粗酶液酶液相关计算公式：比活力U/mg =；纯化倍数=；回收率=六、思考题1、在SOD酶提取步骤中应注意的关键问题是什么？2、综合评价蛋白或酶的提取分离流程优劣的指标有哪些？实验三 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量一、实验目的1、学习SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理；2、掌握垂直板电泳的操作方法；3、运用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。二、实验原理十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）-聚
14、丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便，设备简单等优点。蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中，主要取决于它在某pH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质，主要取决于它们的分子量，与原有的电荷量和形状无关。SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷，
15、其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。在水溶液中，蛋白质-SDS复合物具有相同的构象，近似雪茄烟形的长椭园棒，克服了蛋白质间原有的形状差异。这样蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。蛋白质分子量与电泳迁移率间的关系可用下式表示：lgMr = K bm式中 Mr为分子量；K为常数；b为斜率；m为迁移率。因此，用本法测定蛋白质的分子量只需根据待测蛋白质在已知分子量的标准蛋白质的lgMr迁移率的图中的位置，就能得知分子量。三、试剂与材料30丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后装于棕色瓶，于4冰箱保存备用（可用1-2月）。N,N,N,N四甲基乙二胺（TEMED）。1
