《cscl双重梯度法纯化重组腺病毒的操作规程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《cscl双重梯度法纯化重组腺病毒的操作规程（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、cscl双重梯度法纯化重组腺病毒的操作规程(SOP)目的：使得重组腺病毒得到进一步的纯化原理：根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。主体内容：纯化一种AD（腺病毒）有三个步骤：1，不连续cscl梯度除去细胞主要的污染物和有缺陷的病毒颗粒；2，连续的cscl梯度从有缺陷的病毒颗粒中完全分离出来；3，通过透析（或脱盐）除去cscl。连续的cscl梯度的步骤要整夜的离心分离。一个有效的方法是，在白天竟早的开始第一步，然后在下午的早些的时候可以开始整夜的离心分离。完整的纯化记录包括脱盐，如果按照时间表的话，要大约两天时间。所有的纯化记录设计时是用30ml的sw
2、28转子的离心管或等同物。在理论上，如果分离容量合适的话，其他尺寸大小的管子也好用的。但是要记得离心完要收集条带的。因为污染物的密度和成熟病毒颗粒差不多，分离是两个条带很接近；所以用大直径的管子，病毒条带在管子里会显现得更稀薄更大的空间。因此，用30ml的管子比用12ml的管子更易回采病毒带。，不连续cscl梯度必须注意的是在连续cscl梯度时为了更容易的获得病毒条带，你要首先阔增病毒至少到3 x 108个细胞。1，预冷浮桶式转头(离心机)到4C；2，用自动移液器将8 mL的cscl1.4(53 g + 87 mL of 10 mM Tris-HCl pH 7.9)移入10ml的移液管中，然后
3、，用6ml的cscl1.2 (26.8 g + 92 mL of 10 mM Tris-HCl pH 7.9)覆盖。病毒最后的纯化决定于这梯度的质;3,在层流通风橱中，病毒储存在5%DMEM里，漫漫的将其加到不连续的梯度液的上面，至20ml。这病毒保存液应该来自至少感染了109个的细胞，否则梯度将会负荷过重的。如果病毒保存液不到20ML，用10 mM Tris-HCl pH 7.9加到20ML。4，确保管子平衡得很好，离心100 000 x g (23 000 rpm in SW 28) for90 min at 4C,减速率= 0.5，在层流通风橱中，从转子中小心移出管子，然后用钳子安全的取
4、出管子到台子上。6，用10ml的移液管，抽吸梯度顶部大部分不纯物，7，用胶带粘住每一片被做好标记管子的一边，这是为了防止穿刺时泄漏。8，用18G针头的5ML的注射器，穿刺管子的贴胶带一边，在病毒蓝白条带的最底部进行。注意：在缺陷性或感染了的病毒颗粒条带间可能显得混浊，抽吸时，避免移开这混浊的地方。9，小心抽吸病毒条带(大约 3 mL)，避免收集其他条带和混杂物。从管中移去针头。10，从注射器上除下针头，将含病毒的溶液移到一无菌的15ml的聚丙烯管中。11，增加至少1x容积的TE在下一步前。这步是必须的，为的是使溶液密度降到1.2以下。病毒条带溶液的密度大约是1.345。二，连续cscl梯度1，
5、用梯度仪将12 mL 的 CsCl 液 1.4 和14 mL 的 CsCl 液 1.2的连续cscl梯度倒入离心管。2，在梯度的上面，漫漫加入来自11步骤的稀薄的病毒悬液8-10ml。3，离心100 000 x g (23 000 rpm with SW 28) at 4C for 16-20 hours 减速率=0。4，超速离心后，连续梯度就象是不连续梯度的一步，只是管子底部没有片状沉淀物，这就可以通过穿刺底部获得所要的感染性病毒条带。管子上面（细胞成分）通常很清。大部分碎屑通过第一步的不连续梯度已除去。5，用10ml的移液管，移去管子顶部大部分的梯度和不纯物，同时避免包含病毒的底部的蓝白条
6、带。这将有助于减慢收集时的流速率。6，用20G的针头穿刺底部，收集底部含病毒的蓝白条带。7，让这梯度流进烧杯中，直至病毒条带非常接近管子的底部，然后用一新的50ML的圆锥形管子开始收集。8，当蓝白条带收集结束后，移去圆锥形管，让余下的梯度流入烧杯。注意： 做为选择，像不连续梯度一样，条带也可以用从管子一边穿刺的方法收集。三，病毒透析和浓缩CSCL通过透析除去，这不非常重要，因为高浓缩的CSCL影响病毒感染细胞或组织。透析液的选择决定于最后病毒的用途。如果病毒是用于动物，应避免用甘油做透析液，因为甘油会使注射有困难。用5%PBS蔗糖缓冲液不能提供病毒很好的稳定性，如果病毒需要浓缩到至少5 x 1
7、011 VP/mL时应该避免用其，病毒的精制与pH有关的。10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 4%的蔗糖缓冲液可使病毒浓缩至接近1 x 1013 VP/mL，并能提供很好的稳定性。用纤维素酯膜4oC透析病毒条带，纤维素酯膜分子量筛截(滤纸)25000道尔顿，可 移去盐性的CSCL；病毒的重量在兆道耳顿范围，大小接近90nm。通过三次更换透析液，cscl应该不会有残留。用收集条带容量的200倍体积的透析液，透析至少一小时在换透析液前。透析的病毒应该在-80oC长期保存。它可以在-20oC保存一小段时间。应该提醒的是Ad在反复冻融后感染性已减低。大部分剩余病毒液存在便利的容器中用于以后的实验，一小部分可以单独用来测病毒滴定度。如果透析后病毒太稀，呋吗唑酮（Ultrafree）浓缩器柱子的微孔为空可用于浓缩病毒至10倍以上。但是，10%的病毒会丢失。在用呋吗唑酮（Ultrafree）柱子前，要用70%的酒精灭菌，另外，必须除去剩余残留的酒精在加病毒前（如用无菌的病毒缓冲液冲洗）。
