分子生物学实验思考题答案

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1、分子生物学实验思考题答案实验一、基因组DNA的提取1、 为什么构建DNA文库时,一定要用大分子DNA? 答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小,片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段.2、如何检测和保证DNA的质量? 答、用凝胶电泳看,有没有质白质和RNA等物质的污染,还可以测OD,用OD260/280来判断, 当OD260/OD280 2.0,表示RNA含量较高 当OD260/OD280=1.82.0,表示DNA较纯。实验二、植物总RNA的提取1、 RNA酶的变

2、性和失活剂有哪些?其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种? 答、有DEPC,Trizol,氧钒核糖核苷复合物,RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS,尿素,硅藻土等;在总RNA提取中用PEPC,Trizol 2、 怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。 答、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物,根据碱基互补配对原则,可将mRNA从总RNA中分离出来 实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备1、 感受态细胞制备过程中应该注意什么? 答、A)细菌的生长状态:不要用经过多次转接或储于4的培养菌,最好从-80甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚

3、进入对数生长期时为宜,可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5107 个/mL左右,这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B)所有操作均应在无菌条件和冰上进行;实验操作时要格外小心,悬浮细胞时要轻柔,以免造成菌体破裂,影响转化。 C)经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的); D) 化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或 Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(10

4、0-1000倍); E)所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;2、 感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域? 答、在基因工程中将质粒导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为感受态细胞质粒进入。实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定1、 在热激以后进行活化培养,这时的培养基中为什么不加入抗生素? 答、活化培养用的一般是SOC培养基,这种培养基比LB培养基营养,此时进行的活化培养只是为了让大肠杆菌迅速复苏,恢复分裂活性,此时的细胞还不具抗性,加入抗生素会细胞会死亡。2、 什么是质粒?根据在细菌中的复制,质粒有几种类型?用于基因重组的主要用到

5、哪些质粒? 答、质粒是细菌体内的环状DNA分子。质粒也是作为细菌遗传载体的一部分,但通常其携带的基因对细菌而言必要性要比核内DNA的小很多。比如,抗性基因,荧光蛋白基因等等。 根据质粒随细胞分裂而分裂的次数,将其分为两类:一类是严紧型质粒,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有12个质粒;另一类是松弛型质粒,当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有20个左右质粒。 常用于基因重组的质粒是pBR322质粒,因为其基因测序已经完成,而且它携带了两个标记基因,一个是氨苄青霉素抗性基因Apr,另一个是四环素抗性基因Tetr。实验六、质粒DNA的分离纯化和鉴定1、在实验过程中

6、,加入的EDTA、SDS分别起什么作用? 答、EDTA可以结合DNA酶等,可以抑制其活性;SDS主要是裂解细菌和沉淀蛋白。2、 乙酸钾在实验过程中主要起什么作用? 答、主要是在分离过程中起着中和PH的作用,DNA经碱(NaoH)裂解后,染色体DNA氢键断裂,双螺旋解开,质粒DNA氢键断裂,互补链不能完全分离,再经乙酸钾中和成中性后则复性离心就可以达到分离的效果。3、 氯仿在核酸的提取过程中有何作用? 答、克服酚的特点,加速有机层和液相的分层。最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中迹量酚。4、 本实验整个过程中应该注意些什么? 答、1、提取过程应尽量保持低温; 2、提取质粒DNA过程中除去蛋白质很重要,

7、采用酚、氯仿去除蛋白质要比单独用酚或者氯仿要好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3、沉淀DNA一般使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可以使沉淀完全。沉淀DNA也可以使用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀,所以多数还是用乙醇。实验七、聚合酶链式反应一般原理和技术1、 降低退火温度对反应有何影响? 答、变性所需的加热温度取决于模板及 PCR 产物双链 DNA 中的 G+C 含量。 双链 DNA 中的 G+C 的比率越高,则双链 DNA 分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与 DNA 分子的长度 相关,DNA 分子越长,在特定的变性温度下使双链 DNA 分子完全分离所需的

8、时间就越长。 若变性温度太低或变性时间太短,则只能使 DNA 模板中富含 AT 的区域产生变性,当 PCR 循环中的反应温度降低时,部分变性的 DNA 模板又重新结合成双链 DNA,从而导致 PCR 的失败。非特异性条带数增多。2、 PCR 循环次数是否越多越好?为何? 答、循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。3、 PCR技术可应用与哪些方面?举例。 答、1、核酸的基础研究:基因组克隆 2、 不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序 3、反向PCR测定未知DNA区域 4、反转录PCR(RT-PCR)用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、荧光定量PCR

9、用于对PCR产物实时监控6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达 8、医学应用:检测细菌、病毒类疾病;诊断遗传疾病;诊断肿瘤;应用于法医物证学实验八、DNA的限制性内切酶酶切和鉴定1、写出ECORI和Hind3两种内切酶消化产物的末端序列。 答、GAATTC EcoRI的识别序列和切割位点,粘性末端即:AATTC- CTTAAG G- Hind的识别序列为:AAGCTT “”为切割位点,黏性末端为:AGCTT- A-2、 什么是粘性末端和平末端? 答、用限制酶切割后得到的末端齐平就是平末端,一长一短就是粘性末端3、限制性内切酶在基因工程中有什么作用? 答、用同种限制酶对含目的基因的DNA分子和运载体(如:质粒)进行切割,产生同种黏性末端(核苷酸序列),从而进行重组(加DNA连接酶),以导入目的基因。

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