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1、分子生物学实验思考题答案实验一、基因组DNA的提取1、 为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA? 答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段.2、如何检测和保证DNA的质量？ 答、用凝胶电泳看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断， 当OD260/OD280 2.0，表示RNA含量较高 当OD260/OD280=1.82.0，表示DNA较纯。实验二、植物总RNA的提取1、 RNA酶的变
2、性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？ 答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol 2、 怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。 答、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来 实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备1、 感受态细胞制备过程中应该注意什么？ 答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4的培养菌，最好从-80甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚
3、进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； D） 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（10
4、0-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；2、 感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？ 答、在基因工程中将质粒导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为感受态细胞质粒进入。实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定1、 在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入抗生素？ 答、活化培养用的一般是SOC培养基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让大肠杆菌迅速复苏，恢复分裂活性，此时的细胞还不具抗性，加入抗生素会细胞会死亡。2、 什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到
5、哪些质粒？ 答、质粒是细菌体内的环状DNA分子。质粒也是作为细菌遗传载体的一部分，但通常其携带的基因对细菌而言必要性要比核内DNA的小很多。比如，抗性基因，荧光蛋白基因等等。 根据质粒随细胞分裂而分裂的次数，将其分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。 常用于基因重组的质粒是pBR322质粒，因为其基因测序已经完成，而且它携带了两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因Apr，另一个是四环素抗性基因Tetr。实验六、质粒DNA的分离纯化和鉴定1、在实验过程中
6、，加入的EDTA、SDS分别起什么作用? 答、EDTA可以结合DNA酶等，可以抑制其活性；SDS主要是裂解细菌和沉淀蛋白。2、 乙酸钾在实验过程中主要起什么作用? 答、主要是在分离过程中起着中和PH的作用，DNA经碱（NaoH)裂解后，染色体DNA氢键断裂，双螺旋解开，质粒DNA氢键断裂，互补链不能完全分离，再经乙酸钾中和成中性后则复性离心就可以达到分离的效果。3、 氯仿在核酸的提取过程中有何作用？ 答、克服酚的特点，加速有机层和液相的分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中迹量酚。4、 本实验整个过程中应该注意些什么？ 答、1、提取过程应尽量保持低温； 2、提取质粒DNA过程中除去蛋白质很重要，
7、采用酚、氯仿去除蛋白质要比单独用酚或者氯仿要好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3、沉淀DNA一般使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可以使沉淀完全。沉淀DNA也可以使用异丙醇（一般使用等体积),且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀，所以多数还是用乙醇。实验七、聚合酶链式反应一般原理和技术1、 降低退火温度对反应有何影响？ 答、变性所需的加热温度取决于模板及 PCR 产物双链 DNA 中的 G+C 含量。 双链 DNA 中的 G+C 的比率越高，则双链 DNA 分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与 DNA 分子的长度 相关，DNA 分子越长，在特定的变性温度下使双链 DNA 分子完全分离所需的
8、时间就越长。 若变性温度太低或变性时间太短，则只能使 DNA 模板中富含 AT 的区域产生变性，当 PCR 循环中的反应温度降低时，部分变性的 DNA 模板又重新结合成双链 DNA，从而导致 PCR 的失败。非特异性条带数增多。2、 PCR 循环次数是否越多越好？为何? 答、循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。3、 PCR技术可应用与哪些方面？举例。 答、1、核酸的基础研究：基因组克隆 2、 不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序 3、反向PCR测定未知DNA区域 4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、荧光定量PCR
9、用于对PCR产物实时监控6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达 8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学实验八、DNA的限制性内切酶酶切和鉴定1、写出ECORI和Hind3两种内切酶消化产物的末端序列。 答、GAATTC EcoRI的识别序列和切割位点，粘性末端即：AATTC- CTTAAG G- Hind的识别序列为：AAGCTT “”为切割位点，黏性末端为：AGCTT- A-2、 什么是粘性末端和平末端？ 答、用限制酶切割后得到的末端齐平就是平末端，一长一短就是粘性末端3、限制性内切酶在基因工程中有什么作用？ 答、用同种限制酶对含目的基因的DNA分子和运载体（如：质粒）进行切割，产生同种黏性末端（核苷酸序列），从而进行重组（加DNA连接酶），以导入目的基因。
