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1、年产1000吨苏氨-酸发酵工艺课 程设计目录1绪论11.1苏氨酸简介11.1. 2苏氨酸的作用来源及发展22菌种的选择与制备32.1菌种选择与保藏32.1. 1 菌种选择32. 1. 2菌种保藏32.2培养基的设计32. 2.1培养基配置的原则32. 2. 2培养基类型32. 2.3培养基配方（百分比）52. 2.4培养方法:52.3培养基的营养要求62.4发酵条件的研究72.5灭菌72. 5. 1灭菌方法72. 5. 2培养基的湿热灭菌82. 5. 3分批灭菌92. 5.4分批灭菌的操作方法92. 5.5空气除菌10；g页以小第 页共3页341 绪论1.1 苏氨酸简介L-苏氨酸是一种必需的氨
2、基酸，苏氨酸有四种异构体，天然存在并且对机体 有生理作用的是L-苏氨酸。苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料 添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面的用量增长快速，它常添加到未成 年仔猪 和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨 基酸。在 配合饲料中加入L-苏氨酸，具有如下的特点：可以调整饲料的氨基酸平衡，促 进禽畜生长；可改善肉质；可改善氨基酸消化率低的饲料的营养价值；可 降低饲料原料成本；因此在欧盟国家(主要是德国、比利时、丹 麦等)和美洲国 家，已广泛地应用于饲料行业。在医药方面，苏氨酸是氨基酸大输液的主要成分 之一。常用于手术前后、 创伤、烧伤、骨折、营养不
3、良、慢性消耗性疾病等的辅 助治疗，是临床用量很 大的品种。发酵法生产苏氨酸，其优点是可利用廉价的葡 萄糖原料直接生产产品，菌种特性专一，发酵液中几乎不含其它氨基酸，提纯后 产品质量好，成本低，易于大规模生产。选择具有国际先进水平高产酸、高转化 率基因工程菌种，生产苏氨酸，不但附加值更高，而且能够发挥氨基酸发酵企业 自身的优势，改变氨基酸发酵企业产品单一，利润较薄的状况。发酵法生产氨基酸是利用微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过诱 变 筛选，选育出具有各种缺陷型及抗性的菌株，以解除代谢调节的反馈和阻遏， 达 到过量合成目的氨基酸的生产方法。微生物细胞内的氨基酸合成都是以一些 代谢 中间产物为
4、底物，保证各种氨基酸的平衡和不断供应。1.1.1 苏氨酸的结构理化性质名 称：L-苏氨酸(L-Threonine)(B-羟基-a-氨基丁酸)简写：Thr法定编号： CAS 72-19-5 结构式： CH3CH (OH) CH (NH2) COOH 分子式：C4H9NO31分子量： 119.12白色斜方晶系或结晶性粉末。无臭，味微甜。253C熔化并分解。高温下溶于 水，25 C溶解度为20. 5g/100ml。等电点56。不溶于乙醇、乙醚和氯仿。苏氨酸 在机体内的代谢途径和其他氨基酸不同，是唯一不经过脱氢酶作用和转 氨基作 用，而是通过苏氨酸脱水酶（TDH）和苏氨酸脱酶（TDG）以及醛缩酶催化而
5、转变 为其他物质的氨基酸。途径主要有3条：通过醛缩酶代谢为甘氨酸和乙醛；通过 TDG代谢为氨基丙酸、甘氨酸、乙酰COA；通过TDH代谢为丙酸和a-氨基丁酸。1.1.2 苏氨酸的作用来源及发展苏氨酸是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨 酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中 含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作 用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。其制剂具有促进人体发育抗脂肪肝 药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。同时，苏氨酸又是制造一类高效 低过敏的抗生素单酰胺菌素的原料。苏氨酸用于医药、化学试剂、食品强
6、化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲 料添加剂方面用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲 料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。随着人民生活水平的提高 和养殖业的发展，苏氨酸作为饲料用氨基酸，广泛用于添加仔猪饲料、种猪饲 料、肉鸡饲料、对虾饲料和鳗鱼饲料等。主要食物来源：发酵食品（谷物制品）、鸡蛋、茼蒿、奶、花生、米、胡 萝 卜、叶菜类、番木瓜、苜蓿等。苏氨酸的生产方法主要有发酵法，蛋白质水解法和化学合成法三种，目前 微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法。长期以来，国际市场对苏氨酸 的需求持续稳定增长，是需求增长最快的氨基酸品种之一，特别是在化学及生 化、食品添加剂、
7、饲料添加剂等方面的用量增长快速，大有取代色氨酸而成为 除赖氨酸、蛋氨酸以外的发展最迅速的第三大氨基酸。目前全世界苏氨酸的需 求量不应低于8万t/年，缺口较大，且每年将以10%12%的速度递增。苏氨 酸发酵法菌种来源有大肠杆菌、短杆菌、谷氨酸棒杆菌等。22 菌种的选择与制备2.1 菌种选择与保藏2.1.1 菌种选择关于菌种的选择，通过查资料工业一般使用大肠杆菌基因工程，因其产 量大，没有反馈抑制，本设计采用大肠杆菌基因工程菌发酵工艺来生产苏氨 酸，所以对于菌种来源需要从菌种机构来买。2.1.2 菌种保藏菌种保藏的原理：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以最大 限度的降低菌种的代谢强度抑制
8、细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静 止，生命活动将处于休眠状态，从而可以保藏很长时间。要求保存的菌种在复 苏后除保持以前的生活和繁殖能力，不发生形态特征、生理状态以及遗传性状 的改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，保存前应确保菌种的单纯性，先分 离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。菌种常用的保存的方法有斜面冰箱保 藏法、 沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液 氮超低温保藏法。从菌种机构买回来的菌种，为了保证每次接种的菌种稳定，需要对菌种进 行扩大并保藏，将菌种接种于LB培养基，稳定培养24h，将所得的菌用甘油冷 冻保藏法于-70度保藏。使用时将菌种表面部分融化，挑
9、取少量于摇瓶培养基 中，注意菌种不要全部融化，摇瓶培养所得置于冰箱中供菌种扩大使用。2.2 培养基的设计2.2.1 培养基配置的原则培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也 为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。原则上满足必须的原料；3 第 页共 27页生化反应的基本条件(温度、溶氧和pH)；来源丰富、价格低廉、取材方 便、质量稳定；培养基成分不影响下游产品的提取加工。2.2.2 培养基类型培养基可以按照用途可以分成，菌种扩大培养基，摇瓶培养基、种子培 养基和发酵培养基。(1) LB培养基LB培养基是一种培养基的名称，生化分子实验中一般用该培养基来预培养 菌种,
10、使菌种成倍扩增,达到使用(2) 摇瓶培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这类培养基的要 求是能使菌体生长迅速，产生数量多而且优质的孢子，并且不会引起菌体变异。(3) 种子培养基 种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。(4) 发酵培养基发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的 大量合成。要求培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互 相搭配，少用速效营养，多加迟效营养，还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳 定pH值；并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体 和促进剂等。由于本课
11、题为工业发酵生产，所以选择培养基配料时要注意到经济成本， 选用廉价发酵原料根据本地条件，结合实际情况，可选用合适的碳源和氮源。 采用葡萄糖作为主要的碳源，玉米浆作为底料的氮源，玉米浆除能提供必需的 氮源外还含有利于产酸的有益生长因子，同时辅以适量的无机盐和其他微量元 素。大肠杆菌的培养基配方及其培养条件42.2.3 培养基配方(百分比)LB培养基胰蛋白胨10g/L ，酵母提取物5g/L ，氯化钠10g/L调节pH到74 摇瓶培养基葡萄搪05,牛肉膏1.0，蛋白胨1.0, NaCl05,调节pH值在7.07.2之 间。种子培养基葡萄糖3.5，玉米浆 1.5，(NH4)2 SO40.5，MgSO4
12、0.05，KH2 PO4 0.1， CaC031。溶解后以NaOH调至pH70。发酵培养基葡萄糖 1214,玉米浆3.0, (NH4)2 SO43.5KH2PO401，MgSO401, CaCO32, 以NaOH调pH至7。补料培养基葡萄糖15玉米浆3.0 (NH4)2 SO4 2.0以上培养基均在121C下灭菌20min。2.2.4 培养方法:摇瓶培养基在32C培养1824h经质量检查合格后，即可利用火焰接种法接种于种子 罐。种子培养基接种时以1%的接种量接种于2000L种子罐，搅拌转速300700r/min,通过 自动添加氨水控制pH在7.0。一般培养1820h，取菌种，分析其pH、残糖、
13、菌体 密度及镜检正常后可供发酵罐接种用,利用压差法接种于发酵罐。发酵培养基接种时以10%的接种量接种于20000L标准发酵罐中，其装液量为15000L。 罐内培养条件为：温度32C，气压l00KPa，通风比前期1 : 02,中后期1 : 03,搅拌300r/min,加泡敌作消泡剂。分批补料发酵周期为60h5补料培养基在发酵培养基培养12h后，当总糖浓度低于5.5%时，开始补料，补料计量 根据发酵液情况而定。2.3 培养基的营养要求碳源 主要以淀粉水解糖作为碳源，生产过程中应注意控制其浓度，当碳源浓度 过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。氮源包括铵盐、尿素、氨水等，同时有调节pH值的作用
14、。对于营养缺陷型菌 株应以添加有机氮源水解液为主。需生物素和氨基酸时，应以玉米浆作氮源。 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。氨水用pH自动控制 连续流加。此外，还应注意合适的C/N比。磷酸盐 对发酵有显著影响，不足时糖代谢受抑制，要根据菌种不同的培养及生产 阶段及时的调整用量。镁 镁是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶活力。可通过添加MgS04防止发酵过程中的缺乏。钾 钾可以促进糖的代谢，钾的量较多时利于产酸，钾的量较少时利于菌体生 长。可以根据不同的目的和需要调整钾的用量。 其他微量元素钠可调节细胞内 外的渗透压，一般在调节pH值时加入
15、。锰是许多酶的激活剂。而铜离子则对氨 基酸发酵有明显毒害作用生长因子 生长因子是指氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等菌体必须地生理活性物 质。水 水是生命活动不可或缺的物质，是细胞的主要成分，良好的介质，营养传递 的道体，调节细胞生长。62.4 发酵条件的研究细菌生长曲线可划分为四个时期，即：延迟期，对数生长期，稳定 期，衰亡期。生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中， 生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。生长曲线各个时期的特点，反映了 所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相 互作用与制约的动态变 化。深入研究各种单细胞微生物生长曲线各个时期的特 点与内在机制，在微生物学理 论与应用实践中都有着十分重大的意义。处于对数生长期的细胞，由于代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，个体形态、 化学 组成和生理特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，常用对数期的 菌体作种子， 它可以缩短延迟期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济 效益。对数生长期的 细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特 性的极好材料。因此如果确 定了菌体的生长曲线，那么就可以选择合适的时间 接种，从而达到虽好的发酵效果。在发酵的过程中，苏氨酸产量会随时间呈曲
