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1、构建重组质粒基本方法1. cDNA编码区片段的PCR扩增50ul X2模版15引物13引物1dNTP110Xbuffer5Taq1Milliq H2O402. PCR产物纯化1、加5倍体积的PB2、将Spin柱放于2ml收集管上3、加样液，14Krpm，离心1min4、弃去排出液5、加 0.75ml PE, 14Krpm,离心 1min6、弃去排出液，14Krpm,离心1min7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中8、往Spin柱的膜中央加入50口 l的EB（或mil liq HO），静置2min, 14Krpm,2离心1min3.双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体
2、系均为30ul, 37C,酶切n小时）：载体10ulPCR产物20ul10x buffer3ul10x buffer3ul100xBSA0.3ul100xBSA0.3ul酶11ul酶11ul酶21ul酶21ulMil liQ HO214.7ulMil liQ HO24.7ul4.双酶切后的载体用试剂盒割胶回收1. 割胶并称重，加3倍体积的QG （胶块每100mg约合100 口 l的体积）2. 50C，恒温lOmin,等到胶完全被溶解3. 将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中4. 加样液，14Krpm，离心1min5. 弃去排出液6. 加 0.75ml PE, 14Krpm，离心 1min7
3、. 弃去排出液，14Krpm,离心1min8. 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中9. 往Spin柱的膜中央加入50 口 l的EB（或milliq出0），静置2min, 14Krpm， 离心lmin5连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯 化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16C连接过夜。 连接体系如下：载体2ulPCR 片段6ul10xT4 buffer1ulT4 DNA ligase1ul转化取上述连接液5 口 l转化到预先制备的DH5 a化学感受态细胞中，冰浴30分 钟，42C热激2min,置冰上5min，加入lml
4、LB培养液37C摇床45min，离心 5000rpm， 1-5min （不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37C倒置培养过夜。挑取阳性克 隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37C 倒置培养过夜。7菌落原位PCR挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将 细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2% 凝胶上进行电泳分析。8. QIAGEN试剂盒抽提质粒1） 用 1.5ml 管离心收集细菌，两次，共 3ml 左右。2）加入
5、250ul的预冷的Pl,打匀后在震荡仪上高速震荡lmin。3）加入250ul P2,温和颠倒数次混匀。4）（在5min内）加入冰上预冷的溶液N3 350ul，迅速温和颠倒混匀，至出 现分散的絮状沉淀。5）冰上静置 2min 后离心， l3， 000rpm， l0min。6）小心吸取上清于蓝色的spin柱中（勿吸到沉淀）7）离心13， OOOrpm，lmin，弃流出液8）加入 750ul PE，离心 13， OOOrpm，lmin，弃流出液9）再离心一次，离心13，OOOrpm， lmin，弃流出液。以让管内彻底干燥。10）将spin柱拿出，置于一干净的l.5ml管中，小心的在spin柱中央加入3Oul MilliQ H2O，或者 Elution Buffer，室温静置 2min。11）离心13，OOOrpm， lmin，收集质粒，测浓度，电泳检测。
