《大肠杆菌感受态细胞的制备和转化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒 载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的 接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取 外源DNA。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手 段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲 基化酶的突变体(R 一 ,M -)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受
2、体 细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透 性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进 入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般 实验的要求，制备出
3、的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15 %的无菌甘油于-70 r保存 (半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4r的培养菌，最好从一70r或 -20C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数 生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5a菌株的OD600为0.5时，细胞 密度在5X107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会 影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccD
4、NA)。转化 效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时, 转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50p l的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。3. 试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR,或AR.)，并用超纯水配 制，最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离 心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、 DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为
5、以后的筛选、鉴定 带来不必要的麻烦。本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态,然后与pBS质 粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来 筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养 基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出， 进行电泳、酶切等进一步鉴定。本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态,然后与pBS质 粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可
6、通过Amp抗性来 筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养 基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出， 进行电泳、酶切等进一步鉴定。第二节材料、设备及试剂一. 材料E. coli DH5a 菌株：R 一 ,M 一 ,Amp 一； pBS 质粒 DNA:购买或实验室自制，eppendorf 管。二. 设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机, 分光光度计,微量移液枪。三. 试剂1. LB固体和液体培养基：配方见第一章。2. Amp母液：配方见第一章。3. 含Amp
7、的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60C左右,加入 Amp储存液，使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。4. 麦康凯培养基（Maconkey Agar ）取52g麦康凯琼脂，加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全溶 解，高压灭菌，待冷至60C左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/m 1,然后摇匀后涂板。5.0.05mo1/L CaC12溶液:称取0.28g CaCl2（无水,分析纯）,溶于50ml重蒸水中,定容至 100ml，高压灭菌。6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中, 加入15ml甘油,定
8、容至100ml，高压灭菌。第三节操作步骤一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5a单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中,37C下 振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB 液体培养基中,37C振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。二、感受态细胞的制备（CaCl2法）1、将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟,然后于4C下3000g离心10分钟。2、 弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分 钟后,4C下3000g离心10分钟。3、弃去上清,加入4
9、ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞，冰上 放置几分钟，即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成200p l的小份，贮存于-70C可保存半年。三、转化1、从-70C冰箱中取200p l感受态细胞悬液，室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。2、 加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10p l）,轻轻摇匀，冰上放置 30分钟后。3、42C水浴中热击90秒或37C水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4、向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp）,混匀后37C振荡培养1小时，使细菌恢复 正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp
10、r ）。5、将上述菌液摇匀后取100p l涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌 液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37C培养16-24小时。同时做两个对照：对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况 下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5p l菌液涂布于不含抗 生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。四、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化 子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积/涂板菌液体积转化频率（转化子数/每mg质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量感受态细胞总数=对照组2菌落数X稀释倍数X菌液总体积/涂板菌液体积感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数注意本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的 转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落 平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心），才能较准确的计算转化率。原文地址:http:/
