《分子生物学实验技巧》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验技巧（129页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精选优质文档-倾情为你奉上限制性内切酶基础知识如果没有限制性内切酶，当今的分子生物学研究会是个什么样子？40年来，限制性内切酶这个幕后成员默默推动着许多基础生物学研究和商业化应用 。限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。通常，限制性内切酶会切割双链 DNA。每个限制性内切酶会识别特定的 DNA 序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割 DNA。识别序列长度通常为 4 - 8 bp，酶切之后会形成粘性末端（5 或 3 突出端）和平末端（图 1）。图 1.特定限制性内切酶切割后形成的粘性或平末端（5 或 3 端）示意图
2、。如今业内已经鉴定了大约 4000 种限制性内切酶，其中超过 600种 可商业化供应。是一个非常有用的资源库，可查询限制性内切酶全面信息及更新信息，包括限制性内切酶的特异性、灵敏度和商业化来源等。本页内容：限制性内切酶发展史上世纪 50 年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异。Grasso 和 Paigen 对此的描述如下：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体 感染同一种类的另一菌株（例如，大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌 K 的感染率出现明显下降。新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受
3、”侵入的噬菌体。研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域。直到上世纪 60 年代，人们才发现宿主控制变异的机制，其与噬菌体 DNA 的酶切有关，进而发现并分离出了限制性内切酶。上世纪 60 年代初 Werner Arber 观测发现，宿主范围的决定性遗传物质都存在于噬菌体 DNA之中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护。这些发现最终催生了限制性修饰 (R-M) 体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基
4、化） DNA，同时保护宿主的 DNA 不受甲基化。颇为有趣的是，大多数 R-M 体系的早期研究工作围绕限制性内切酶的 Type I 和 Type III 基团进行，该分类方法主要依据限制性内切酶的结构和功能（参见）。然而在 Kent Wilcox 和 Hamilton Smith 发现第一种 Type II 级限制性内切酶 HindII 之前，限制性内切酶显然还未得到充分利用。HindII 能够识别特定的对称 DNA 序列，按照精确的方式切割识别序列内的位点。此功能（大多数早期 Type II 限制性内切酶均发现存在此功能）促使 Kathleen Danna 和 Daniel Nathans
5、使用 HindII 研究猿猴空泡病毒 40 DNA，即所谓的限制性内切酶图谱。凭借在限制性内切酶方面的开创性研究，Daniel Nathans、Hamilton Smith 和 Werner Arber 共同获得 1978 诺贝尔生理学或医学奖。随着 DNA 连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶家族不断壮大，重组 DNA 技术应运而生。限制性内切酶命名规则该命名规则综合考虑到内切酶来源的三种特性属名、种名和菌株或血清型组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶。例如，HindIII 酶（或者按照早期命名规则命名为Hind III）代表： “H”代表Haemop
6、hilus “in”代表influenzae “d”代表血清型d “III”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶（例如， HindII 和 HindIII）。限制性内切酶分类根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类。表 1汇总了各类内切酶的区分特点表 1.限制性内切酶类别和特性。内切酶类别特点Type I 同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白 需要ATP 切割位点与识别位点间的间距不定Type II 特异性的识别序列 切割位点位于识别序列内或邻近识别序列 在切割位点生成 5 磷酸基和 3 羟基末端 需要 Mg
7、2+Type III 由两个相反方向的识别序列组成 切割位点与其中一个识别序列的间距恒定 需要ATPType IV 仅切割甲基化的 DNA 切割位点大约距离识别位点 30 bp由于自身特殊的特点， Type II 限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学 DNA 分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。这类内切酶的特殊切割方式使其得以应用在分析，而后者也是法医学研究的基础。连接酶可酶促连接 DNA 末端的 5 磷酸基和 3 羟基，从而使得DNA可以通过限制性内切酶产生的5 磷酸基和 3 羟基末端进行重排和连接这也是重组 DNA 技术的基本原理。由于在分子生物学研究方面很有用处，Type II 限制
8、性内切酶成为了研究最多的酶类别，其成为了最大的内切酶类别。目前经过鉴定的 Type II 限制性内切酶超过 3,500 种，这些酶又被进一步细分成 Type IIP、IIA、IIB、IIC、IIS 等子类别其中的 Type IIP 酶可识别回文（对称）靶标序列，是最流行的商业化限制性内切酶。识别位点和切割特异性另一个将限制性内切酶进行分类和比较的重要方法是同裂酶和异裂酶。 同裂酶是具有相同识别序列及相同特异性的限制性内切酶。例如，AgeI 和 BshT1 可通过相同的图谱识别和切割 5-ACCGGT-3。但一系列同裂酶可能在首选位点、反应条件、甲基化敏感度和星号活性方面存在差异。 异裂酶可以识
9、别相同的核苷酸序列，但会在不同的位点切割 DNA。例如，异裂酶 SmaI (5-CCCGGG-3) 和 XmaI (5-CCCGGG-3)均可识别 5-CCCGGG-3 但切割方式不同，因而产生不同类型的末端（此时，SmaI 产生平端，而 XmaI 产生 5 突出末端）。识别序列和切割图谱方面的不同使限制性内切酶成为极其灵活、强大的基因材料鉴定和操作工具。参考文献1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.限制性内切酶关键注意事项限制性内切酶一般反应条件当进行限制性酶切反应时，为确保最佳的反应条件，务必要遵守限制性内切酶供应商提供的建议。在此过程中需要考虑的重要参数包括：底物 (DNA) 和酶的
10、量、反应体积以及孵育时间。根据传统的定义，在最佳反应条件下，一个单位的限制性内切酶可以在1小时内，在 50 L体系中 完全酶切 1 L 定义底物（例如，质粒 pUC19）。尽管单位定义提供了一种测定方式，但还需注意，根据 DNA 底物之中的识别序列出现的频率及所用底物类型，针对不同DNA底物使用等量的限制性内切酶可能需要不同的最佳反应条件。实际上，酶供应商往往根据 DNA 样本的潜在质量、数量和性质波动，推荐比完全酶切所需量多 5 至 20 倍的酶（或 1 L 酶/反应体积）。为确保限制性内切酶的有效活性，应按照制造商的建议妥善存储并在过期前使用。通常情况下，应将酶分成小等份，存储在 20C
11、条件下的无霜冰箱之中，从而在维持活性的同时最大限度避免反复冻融。DNA 样本应避免接触可能抑制酶并造成其它负面效应的污染物，如核酸酶、盐、有机溶剂（例如，苯酚、氯仿或乙醇）以及洗涤剂。为避免在 20C 条件下结冰，限制性内切酶往往采用 50% 的甘油溶液形式提供。但甘油自身的粘度可能导致反应配制阶段移液和少量酶加样较为困难。最好是最后添加酶至终体积，添加之后就充分混匀。“用手指轻弹反应管”轻柔混匀，然后短暂离心反应管，可帮助酶在反应混合物中充分扩散，并在反应管底部收集到反应溶液。在孵育过程中，反应须达到所需的温度，并在整个孵育期间保持恒定。如果使用 5-15分钟完全酶切的快速限制性内切酶代替1
12、小时酶切的传统限制性内切酶时，这一点尤为重要。须格外谨慎地密封反应管以避免样本蒸发，否则可能造成孵育时间延长（例如，延长至1 小时）和体积减少（例如，减少至5%）、低浓度盐、非最佳 pH、存在有机溶剂，以及除 Mg2+之外的二价阳离子都可能造成底物 DNA 的非特异性切割。使用酶制造商推荐的实验方案和缓冲液，可避免出现星号活性。不完全酶切不完全酶切是在限制性内切酶使用过程中常遇到的问题之一。当酶量过多或过少时，都可能发生不完全酶切。DNA 样本中存在污染物也可能导致不完全酶切。缓冲液组分、孵育时间和反应温度等欠佳的反应条件是不完全酶切的常见原因。部分限制性内切酶需要辅因子才能实现完全活性。例如
13、，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而 Eco57I (AcuI) 需要 S-腺苷甲硫胺酸。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限制性内切酶需要两个拷贝的识别位点才能实现有效切割；针对这一类酶，通常向反应物之中添加一份带有识别位点的寡核苷酸来增强酶活性。除了反应条件和酶性质外，DNA 自身的性质也会影响限制性酶切（表 1）。甲基化的 DNA 可耐受部分限制性内切酶的切割（详见）。酶的识别位点过于接近终端（线性底物 DNA 中）以及切割位点相邻（双酶切）都可能影响酶切割 DNA 的效率）。此外，部分超螺旋 DNA 分子要比线性 DNA 分子更难切割，增加 5-10 倍的酶量可有
14、助实现完全酶切。表 1.不完全酶切的常见原因。反应条件酶要求底物 DNA 条件 酶量过少 底物过多 pH 条件欠佳 温度欠佳 孵育时间过短 辅助因子 识别序列要求 首选位点 甲基化 限制性位点邻近 结构酶供应商在产品说明书中提供了使用建议，为实现完全酶切，必须严格遵守此类建议。预料之外的切割图谱即便遵守了制造商的使用说明，仍可能观察到预料之外的底物 DNA 切割结果。为避免陷入此类困境，必须确保酶和 DNA、反应所用的试剂均不含污染物（例如，其它限制性内切酶、DNA 和核酸酶）。出现预料之外切割的一个原因是，在增殖和扩增过程中，底物 DNA 引入了突变。突变可能破坏已知的识别位点或创造出新的识别位点，从而产生预料之
