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1、编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页 共1页我公司相关资料龙葵总碱作用机理之最新研究基质金属蛋白酶肿瘤，尤其是恶性肿瘤，是引起人类死亡的主要疾病之一。在原发灶的远处组织形成转移灶的能力（即转移的能力）是高度恶性肿瘤的一个重要特征，而肿瘤的转移性也是癌症引起死亡的主要原因。对于绝大多数原发灶肿瘤细胞来说，其中只有一小部分具有转移能力。这些具有高度转移能力的细胞具有以下几种特性：脱离原发肿瘤组织，向淋巴管或血管中迁移，穿过血管基底膜，穿透血管腔，逃脱免疫监视，与远离原发灶器官的血管内皮细胞粘附，离开血管（extravation）,在被侵入的微环境中存活和生长。现
2、在的观点认为基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases,MMP）在肿瘤侵袭和转移过程中起重要作用。MMP在肿瘤侵袭转移中的作用曾一度被认为只是破坏基底膜及ECM中的其他部分。现已确认MMP在肿瘤演进的多个阶段均有作用，它影响肿瘤的起始、生长、血管生成、进入血管/离开血管和转移。因此，研究抗肿瘤药物对MMPs的影响，对研究药物的抗肿瘤转移方面具有重要意义1.关于龙葵中生物碱对肿瘤细胞MMPs的影响，尚未见报道。本次实验，我们建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，观察龙葵总碱对MMP-9基因mRNA表达的影响，初步探讨其抗肿瘤转移的作用机理。（一） 实验材料：1、药材与试剂：
3、龙葵总碱,6mg/瓶，由吉林市卓怡康纳制药有限公司提供，批号：20050602；A549、LLC肿瘤株，由南京中医药大学惠赠；注射用环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：06011921；生理盐水，南京小营制药厂，批号：2005052505；戊巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司（进口分装），批号：F20020405.2、实验动物：C57BL/6J小鼠，6-8周龄，由南京大学模式动物中心提供，生产许可证：2005-0002.3、实验仪器：GS-15R台式冷冻离心机（Beckman）;DK-8D电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司）；CO2培养箱（Forma scient
4、ific）;Pureplus纯水器（U.S.A）;SW-CJ-1FD净化工作台（苏净集团安泰公司）；Leica-DMIL型倒置显微镜（Leica）;MP12001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司；AR2140型电子分析天平，奥赛斯国际贸易（上海）有限公司。4、实验条件：给药前后，小鼠分笼饲养，用全价颗粒饲料（由江宁青龙山动物繁殖场提供）喂养；温度20-25，湿度40-60%。5、统计方法：本实验量反应资料采用方差分析，统计软件用SPSS13.0。IC50计算LOGIT法。（二） 实验方法：取接种Lewis肺癌14天的C57BL/6J荷瘤小鼠，脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织，按肿瘤质量（g）
5、与生理盐水（ml）1：3制备匀浆液，500转/分钟离心5分钟，弃上清，用生理盐水调整细胞数1106/ml备用，取C57BL/6J小鼠40只，分别于右腋皮下接种匀浆液，每只0.2ml（细胞数2105）。接种后每日观察小鼠，等小鼠肿瘤长出，体积约为1cm3时，按肿瘤体积将上述小鼠随机分为5组：生理盐水（saline）组、龙葵总碱（SNSA）低、中、高剂量组和环磷酰胺（CTX）组。分组后每组给予相应药物。龙葵总碱低、中、高剂量组剂量分别为2、4、8mg/kg，腹腔注射，连续给药5天。环磷酰胺60mg/kg，每隔7天给药一次。生理盐水组注射同体积生理盐水。第14口脱颈椎处死各组小鼠，取皮下瘤块，迅速放
6、入液氮中保存，待测MMP-9基因mRNA表达2-4。用RT-PCR法检测Lewis肺癌组织MMP-9基因表达。检测方法如下：（1）耗材处理：0.1%DEPC水浸泡组织匀浆管、1.5ml离心管、0.6ml离心管、1000l、100l、10l枪头等过夜。弃DEPC水，高压蒸汽灭菌组织匀浆管、1.5ml离心管、0.6ml离心管、1000l、100l、10l枪头等。主要试剂：RNAiso为TAKARA产品，RT-PCR试剂盒为PROMEGA产品，dNTPs、MgCl2、rTaq PCR聚合酶、PCR DL2000 Marker为TAKARA产品，其余试剂为进口分装。（2）大鼠组织提取总RNA及纯度鉴定
7、：取材：每组分别随机6各组织（模1、2、4、5、7、8；阳1、3、4、6、7、8；高1、2、3、4、5、6；中1、2、3、4、6、8；小1、2、3、4、5、7），切取约50-100mg组织/管。每管加入1mlRNAiso试剂，匀浆器中进行匀浆至无组织碎片，移入1.5ml离心管中。室温静置10min。台式高速冷冻离心机（美国IEC公司，MP4R）每管加入0.2ml氯仿，小心盖上盖子，有力振荡混合液15s，室温放置5min。4、12000g离心15min小心将水相转移至一干净的离心管内，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置30min。4、12000g离心10min弃上清，加入75%乙醇1ml，4、
8、12000g离心5min。弃乙醇上清，干燥，加入无酶水，轻振荡使溶解，离心、混匀，转入80保存。总RNA纯度鉴定：取出各组总RNA少量，核酸蛋白定量仪（德国EPPENDORF公司，EPPENDORF）检测各组总RNA浓度及纯度，各组总RNA纯度A260/280值在1.70-1.80。（三） 实验结果龙葵总碱制剂各组和模型组相比，MMP-9基因mRNA表达均降低，其中高剂量和模型组比较，有显著性差异（P0.01）。（四）小结基质蛋白溶解在机体的许多生理和病理过程中都会发生，如生长、发育、组织修复以及肿瘤生长。基质金属蛋白酶（MMPs）家族，包括胶原酶、凝胶酶、基质溶解酶和模型金属蛋白酶类。在细胞
9、外基质的降解过程中起重要作用。MMP的活性通过蛋白酶的激活而被严格调控，在此过程中有特殊的组织抑制因子的参与。在MMPs中，两种凝胶酶（MMP-2凝胶酶A和MMP-9凝胶酶B）来自于独特的亚家族，具有改变位于基底膜上胶原（凝胶）和IV型胶原的底物特异性。这种IV型胶原溶解活性和小鼠黑色素瘤以及人结肠癌潜在转移性的增加密切相关。最近研究显示，不仅肿瘤细胞表达MMP-2和MMP-9，肿瘤细胞周围的宿主细胞也同时表达MMP-2和MMP-9。提示宿主细胞分泌的凝胶酶对肿瘤生长也起一定作用。在本次实验中，龙葵总碱具有较强的抑制肿瘤组织MMP-9基因mRNA表达作用，显示其具有一定的抗肿瘤转移作用，这也可
10、能是治疗恶性肿瘤的作用机理之一。（五）参考文献1丁岩，陈晓光/基质金属蛋白酶与肿瘤的侵袭和转移J.哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2002，18（4）：373-3782郭斌，韩冠英，李智。红鱼软骨多糖对Lewis肺癌MMP-9表达的影响J。中国中药杂志，2006，31（4）：325-3283Yang SF,Chu SC,Liu SJ, etc.Antimetastatic activities of Selaginella tamariscina (Beauv.)on lung cancer cells in vitro and in vivoJ.Journal of Ethnopharma
11、cology,2007;110(3):493-9.4Eliane Shizuka Nakamura,Keiichi Koizumi,Mitsuo Kobayshi, etc.Inhibition of lymphangiogenesis-related properties of murine lymphatic endothelial cells and lymph node metastasis of lung cancer by the matrix metalloproteinase inhibitor MMI270J.Cancer Sci,2004,95(1) 2531.第 1 页 共 1 页
