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1、第十六章DNA的复制与修复-王镜岩生物化学第三版笔记(完美打印.txt43风帆，不挂在桅杆上，是一块无用的布；桅杆，不挂上风帆，是一根平常的柱；理想，不付诸行动是虚无缥缈的雾；行动，而没有理想，是徒走没有尽头的路。44成功的门往往虚掩着，只要你勇敢去推，它就会豁然洞开。 第十六章DNA的复制与修复 第一节 DNA的复制 一、半保留复制（semi-conservation replication）（一）证据：1.用氮15标记大肠杆菌DNA，然后在氮-14中培养，新形成的DNA是杂合双链，即双链中一条是重链（约重1），一条是轻链。第二代则有一半全是轻链，一半是杂合双链。2.大肠杆菌DNA在用氚标记
2、的胸苷复制近两代，放射自显影，未复制部分银密度低，由一条放射链和一条非放射链组成；已复制部分有一条双链是放射的，一条双链有一半是放射的。这证明大肠杆菌DNA是环状分子，以半保留方式复制。（二）特点：子代保留一条亲代链，而不是将它分解。这说明DNA是相对稳定的。双螺旋DNA（或RNA）是所有已知基因的复制形式。二、复制的起点和单位（一）基因组能独立进行复制的单位称为复制子。原核生物是单复制子，真核生物是多复制子。每个复制子有起点。通过测定基因出现的频率可以确定起点位置，距离起点越近的基因出现的频率越高。起点有发动复制的序列，也有决定拷贝数的序列。起点的结构是很保守的。（二）复制终止点：已发现Ec
3、oli的与复制终止有关位点，其中含有23bp的保守序列，由tus蛋白与此位点结合参与复制的终止。真核生物中似乎没有复制终止点。（三）复制多数是双向、对称的，但也有例外。通过放射自显影可以判断复制是双向还是单向：先在低放射性培养基中起始复制，再转移到高放射性培养基中，如是双向复制，其放射自显影图是中间银密度低；单向复制则为一端低。（四）单向复制有一些特殊方式：1.滚动环：噬菌体X174DNA是环状单链分子，复制时先形成双链，再将正链切开，将5连接在细胞膜上，从3延长，滚动合成出新的正链。2.取代环：线粒体DNA复制时是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，呈D环形状。这是因为两条
4、链的复制起点不同，另一条链的起点露出才能复制。三、有关的酶（一）反应特点：1.以四种dNTP为底物2.需要模板指导3.需要有引物3-羟基存在4.DNA链的生长方向是5-35.产物DNA的性质与模板相同（二）大肠杆菌DNA聚合酶1.DNA聚合酶I：单链球状蛋白，含锌。有聚合酶活性和外切酶活性，其中3-5外切酶活性起校正作用，5-3活性起修复和切除引物作用。DNA聚合酶I主要起损伤修复作用。每秒可聚合10个碱基。切除氨基端5-3外切酶活性后称为Klenow fragment，用于引物标记等。2.DNA聚合酶II：单链，以切口双链DNA为模板，作用不清楚。3.DNA聚合酶III：起DNA复制作用，功
5、能与聚合酶I相似。全酶共10种亚基，含锌。每秒可聚合1000个碱基。（三）真核生物DNA聚合酶：有a、b、g、五种，性质与大肠杆菌的酶相似，多无外切酶活性。a相当于聚合酶III，用于引发、滞后链合成；b主要起修复作用，位于线粒体，合成前导链，但前50个碱基由a合成。（四）DNA连接酶：使双链DNA切口处的5-磷酸和3-羟基生成磷酸二酯键。需供能，细菌用NAD，动物和噬菌体用ATP，形成焦磷酸键的活化形式，再由3羟基发动亲核攻击，形成磷酸二酯键。大肠杆菌的连接酶作用于粘末端，T4的还可作用于平末端。四、半不连续复制（semi-discontinuocos replication）（一）复制叉由5
6、向3方向连续复制，称为前导链；另一条链复制叉由3向5移动，而DNA复制方向不变，形成许多不连续片段，称为冈崎片段，最后连接成完整的DNA，称为滞后链。（二）首先由引物合成酶由5向3方向合成10个核苷酸以内的RNA引物，然后聚合酶III在引物3-羟基上合成DNA，再由聚合酶I切除引物，填补空白，最后DNA连接酶将冈崎片段连接起来，形成完整DNA。（三）复制具有高度忠实性，其错配几率约为10-10，从热力学上考虑，碱基发生错配的几率约为10-2，酶对底物的选择作用和校正作用各使错配几率下降10-2，所以体外合成DNA的错配几率为10-6。体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性，修复系统对错配加以纠
7、正，进一步提高了复制的忠实性。五、解链复制时必需解链，如靠旋转，则大肠杆菌DNA要达到每分钟6000转。其实复制时是用拓扑异构酶和解螺旋酶来解链的。拓扑异构酶I可切断一条链，牵引另一条链通过切口，再连接起来。每次可消除一个负超螺旋，不需要ATP。同转录有关。拓扑异构酶II每次引入2个负超螺旋，需要ATP。引入负超螺旋可消除复制叉前进带来的张力，促进解链。解螺旋酶通过水解ATP来解开双链，每对碱基需2个ATP。单链结合蛋白(SSB)可与解开的单链结合，防止复性和水解。六、DNA复制体的结构七、与DNA复制有关的酶和蛋白质因子由30多种，他们在复制叉上形成离散的复合物，彼此配合，进行高度精确的复制
8、，这种结构称为复制体。引物合成酶与另外6种蛋白构成引发体。在DNA复制叉上进行的基本活动包括：（一）双链的解开（二）RNA引物的合成（三）DNA链的延长（四）切除引物，填补缺口，连接相邻的DNA片断（五）切除和修复尿嘧啶和错配碱基。八、真核生物DNA的复制（一）真核生物有核小体结构，复制速度慢，复制叉每分钟移动约10003000碱基对，而细菌约为50千碱基对。真核生物有许多复制起点，复制子只有细菌的几十分之一，所以复制时间在同一数量级（E.coli 4.2Mb，酵母、果蝇40Kb，植物300，蛙200，鼠150Kb）。快速生长的原核生物，其复制起点可连续复制，而真核生物采取多复制起点的方法加速
9、复制。（二）真核生物复制时，核小体打开，组蛋白直接转移到子代前导链上，滞后链用新合成的组蛋白。所以DNA是半保留的，而组蛋白是全保留的。真核生物冈崎片段长度约为200碱基对（E.coli 12Kb），相当于一个核小体的长度。（三）真核生物的增殖周期可分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有丝分裂期（M期）等四个时相，间期为分裂期作准备，进行生物大分子和细胞器的倍增。前期合成DNA复制必须的蛋白质和RNA，复制期先复制常染色质DNA，再复制异染色质。然后进入有丝分裂的准备期。前期变动较大。分裂期后，有些细胞进入前期，开始下一个周期；有些失去分裂能力；有些脱
10、离分裂周期，或进行分化，或进入静止期（G0期）。成年动物大部分细胞处于静止期。九、DNA复制的调控复制有复杂的调控机制。有正调节，也有负调节。有顺式作用，即以某DNA序列为调控因子；也有反式作用，即以基因的产物，如蛋白质或RNA为调控因子。原核生物的复制起点与细胞膜相结合，复制与细胞膜有密切关系。真核生物复制从核膜开始，与质膜也密切相关。dnaA浓度决定起始频率。第二节 DNA的修复 一、DNA的损伤（一）环境作用1.物理因素2紫外线：形成嘧啶二聚体，使转录终止，复制受阻。2电离辐射：X-射线等，主要通过电离作用造成损伤。可造成多种损伤，如DNA断裂、碱基脱落、杂环破裂、氧化等。2.化学因素2
11、烷化剂：有活泼烷基，可转移到碱基或磷酸上，如硫酸二甲酯、芥子气等。鸟嘌呤的O6和N7最易烷化，导致错配(GT)或脱落。磷酸三酯不稳定，易断裂。双功能试剂可造成交联。2碱基或核苷类似物：FU、BrdU、6-巯基嘌呤等。可竞争抑制核苷酸合成或掺入核酸导致错配。2亚硝酸盐及亚硝胺：前者造成脱氨，后者氧化后生成烷化剂和自由基。2代谢活化化合物：如苯并笓、黄曲霉毒素等。经混合功能氧化酶催化形成环氧化物，与核酸结合，造成突变。以上物理及化学因素统称诱变剂。3.生物因素2DNA、RNA肿瘤病毒可插入基因组，引起突变。（二）自发性损伤1.复制时的碱基错配2.互变异构：ANH时可形成A=C，GOH时可形成GT三
12、键配对3.碱基脱氨：C-U，A-I，G-X4.碱基丢失：大肠杆菌每代丢失一个嘌呤，哺乳动物可达一万个。嘧啶丢失几率只有嘌呤的120。二、光复活光复活酶可被可见光（300600纳米，400纳米最有效）激活，分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。此酶广泛存在，但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞，且是次要修复方式。三、切除修复（一）细胞内有多种特异的核酸内切酶，可识别DNA的损伤部位，在其附近将DNA单链切开，再由外切酶将损伤链切除，由聚合酶以完整链为模板进行修复合成，最后有连接酶封口。（二）碱基脱氨形成的尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤可被专一的N-糖苷酶切除，然后用AP（apurinic/apyri
13、midinic，缺嘌呤或缺嘧啶）核酸内切酶打开磷酸二酯键，进行切除修复。DNA合成时消耗NADPH合成胸腺嘧啶，可与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶相区别，提高复制的忠实性。RNA是不修复的，所以采用廉价的尿嘧啶。（三）切除修复不需光照，也称暗修复。大肠杆菌中有UvrABC系统，可切除修复嘧啶二聚体。人体缺乏相应系统则发生着色性干皮病，皮肤干燥，有色素沉着，易患皮肤癌。可加入T4内切酶治疗。四、重组修复 以上修复发生在复制前，称为复制前修复。复制时未修复的损伤部分会留下缺口，通过遗传重组进行修复：从完整的母链上将相应序列移至缺口处，用再合成的序列填补母链的空缺。此过程也叫复制后修复。重组修复中原损伤没有
14、除去，但若干代后可逐渐稀释，消除其影响。所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶，如重组蛋白A、B、C及DNA聚合酶、连接酶等。五、诱导修复 DNA严重损伤能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应，包括修复效应、诱变效应、分裂抑制及溶原菌释放噬菌体等。细胞癌变也可能与应急反应有关。应急反应诱导切除和重组修复酶系，还诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，加快修复，避免死亡，但提高了变异率。单链DNA诱导重组蛋白A，可水解Lex A蛋白，使一系列基因得到表达，如RecA、UvrABC、SOS修复所需的酶等，产生应急反应。应急反应可作为致癌物的简易检测方法。采用缺乏修复系统、膜透性高的E.coli突变株
15、，并添加鼠肝匀浆液。六、Ada蛋白也叫适应性蛋白，可识别甲基化的DNA，将甲基转移到自身的半胱氨酸上，不可逆，故称自杀修复。可修复磷酸及鸟苷上的甲基。七、真核细胞修复特点1. 多聚腺苷酸核糖化：由多聚(ADP-核糖)聚合酶催化，用NAD合成并转移到相应蛋白上。可增加一些修复酶的活性，如连接酶。2. 转录修复偶联：转录时，若模板链损伤，则转录暂停，转录因子TFIIS使聚合酶退回，CSA/CSB及TFIIE召集修复。若DNA双链损伤，则模板链优先修复。第三节 逆转录生成DNA 一、逆转录酶含两个亚基，a亚基是b亚基水解产生的。含锌。要求有模板和不少于四个核苷酸的引物，由5向3合成DNA。真核生物的信使RNA加入寡聚dT后可作为模板。此酶有多种功能，可先合成DNARNA杂合分子，再水解RNA（RNA酶H活力），然后复制其互补链，形成双链DNA。二、逆转录过程 以前任宿主的tRNA为引物,为复制末端,需要借助末端重复结构进行跳跃。三、意义（一）逆转录与细胞恶性转化有关，为肿瘤的研究和防治提供了重要线索。艾滋病、乙肝等也有逆转录过程。（二）逆转录病毒经过改造，可作为信息载体，用于肿瘤和遗传疾病的基因治疗。 真核生物的基因组中多含逆假基因，可能是信使RNA经逆转录而整合到基因组中的。所以真核生物正常细胞也存
