单域抗体的研究和应用进展

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1、编号：XXXX时间：2021年x月x日标签:标题页码：第3页 共13页单域抗体的研究和应用进展单域抗体的研究和应用进展 本文关键词：抗体，进展，研究单域抗体的研究和应用进展 本文简介：摘要：传统IgG抗体分子一般由轻链和重链组成，轻链包含一个可变区（VL）和一个恒定区（CL）,重链包含一个可变区（VH）和3个恒定区（CH1,CH2,CH3）.单域抗体（singledomainantibody,sdAb）,是指缺失抗体轻链，而只有重链可变区的一类抗体，因其分子量小，也被称为纳米抗体单域抗体的研究和应用进展 本文内容：摘要：传统Ig G抗体分子一般由轻链和重链组成， 轻链包含一个可变区 （VL）

2、和一个恒定区 （CL） , 重链包含一个可变区 （VH） 和3个恒定区 （CH1, CH2, CH3） .单域抗体 （single domain antibody, sd Ab） , 是指缺失抗体轻链， 而只有重链可变区的一类抗体， 因其分子量小， 也被称为纳米抗体 （nanobody） .上世纪九十年代， 单域抗体最早在骆驼科动物中被发现， 之后在护士鲨， 大星鲨和鳐鱼等软骨鱼纲动物中也发现了类似的抗体。单域抗体虽然结构简单， 但仍然可以达到与传统抗体相当甚至更高的与特异抗原结合的亲和力。相比于传统抗体， 单域抗体具有分子量小、稳定性强、易于重组表达等优点。近年来在生物学基础研究和医学临床应

3、用方面均备受关注并被广泛应用。本文将从单域抗体的结构特征、理化性质、筛选方法以及其在生物医学领域的重要应用进展进行综述。关键词：重链抗体； 单域抗体； 骆驼； 纳米抗体；传统抗体分子 （Ig G） 在结构上是由两条相同的重链和两条相同的轻链组成， 此种结构在哺乳动物中均是非常保守的。抗体分子的轻链包含了一个VL区和一个CL区 （图1） , 而重链则拥有1个VH区和3个CH区 （CH1、CH2和CH3） .VH区和VL区之间通过二硫键相互连接形成抗体的可变区 （Fv） , 是抗体识别抗原的最小单位， 抗体可变区的序列差异决定了抗体能够特异地识别不同的抗原。而CL区和CH区则是相对保守的， 被称为

4、抗体的恒定区， 其中CH区的CH2和CH3两个区域对于抗体招募免疫细胞发挥ADCC （抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用） 和CDC （补体依赖的细胞毒性作用） 功能有着重要的作用1-2.1993年布鲁塞尔自由大学的HamersCasterman等首先报道了骆驼血液中除了传统的Ig G抗体外还存在另一种类型的抗体， 与传统的哺乳动物抗体Ig G分子结构不同， 这种抗体既缺失传统抗体的轻链， 也缺少重链恒定区的CH1区域， 被称为重链抗体 （Heavy chain antibody, Hc Ab） .重链抗体的可变区仅由抗体重链的可变区组成 （图1） , 与传统抗体的Fab类似， 该可变区可以与抗

5、原特异性的结合， 因此重链抗体可以发挥和传统抗体一样的功能。在哺乳类动物中， 目前只有在胼足亚目的骆驼科动物血液中发现含有功能性的重链抗体， 同属于偶蹄目的反刍亚目和猪形亚目动物体内未发现这类抗体3.Hc Ab普遍存在于各种骆驼科动物中， 包括单峰驼Camelus dromedarius、亚州双峰驼Camelus bactrianus、南美洲的大羊驼Lama glama、原驼Lama guanicoe、羊驼Vicugna pacos等动物中均有发现， 尽管其所占比例略有不同， 如在南美洲羊驼的血液中重链抗体比例为10%–25%, 而在普通的双峰骆驼中则高达50%–80%

6、4-5.除了骆驼科动物外， 在护士鲨 （又称为铰口鲨， nurse shark, Ginglymostoma cirratum） 、大星鲨 （Smooth dogfish, Mustelus canis） 、白斑角鲨 （Spiny dogfish, Squalus acanthias） 、鳐鱼 （Skate） 和魟鱼 （Ray） 等软骨鱼纲动物血液也存在类似结构的抗体。在这些远古的物种血液中除了有异源四聚体的Ig M和Ig W抗体外， 还有一种被称为新抗原受体 （Ig new antigen receptor） 的重链抗体， 简称为Ig NAR6, 这类抗体由两个相同的重链组成， 重链包含5个

7、恒定区和1个可变区 （图1） .无论是骆驼科动物来源的Hc Ab还是软骨鱼来源的Ig NAR, 其特异性结合抗原的均为单一重链的可变区， 分别被称为VHH （Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH） 和VNAR （Variable domain of new antigen receptor, VNAR） .采用分子生物学技术直接克隆并重组表达VHH或VNAR, 可获得只含有单个结构域的最小单元抗原结合片段， 被称为单域抗体 （Single-domain antibodies, sd Abs） , 亦被称为纳米抗体

8、 （Nanobody） .单域抗体通常只由110-130个氨基酸组成， 分子量仅有12–15 kD a, 远远小于传统完整抗体 （150–160 kD a） 及其Fab片段 （约50 kD a） , 但却能具备与传统抗体相似或更高的特异性抗原亲和力。单域抗体固有的分子量小、理化特征稳定、亲和力高和易于重组表达制备的特点使得其在被发现后备受关注， 经过20多年的研究， 在免疫研究、诊断检测、医学和生物学成像、治疗性抗体发展等领域的应用均取得了积极进展。本文主要从sd Abs的结构和理化特征、筛选和制备方法、在生物学和医学研究中的应用等方面分析了单域抗体的新近研究进展， 并

9、展望了其进一步发展和应用的前景以及面临的问题。1 单域抗体的理化性质相比于传统抗体而言， 单域抗体有着独特的理化性质。主要包括以下几点： （1） 单域抗体的分子量小， 因为没有轻链的存在， 单域抗体VHH的大小只有15 k Da左右， 鲨鱼来源的单域抗体VNAR因为缺少CDR2区 （Complementaritydetermining region 2, 互补决定簇2） , 只有12 k Da左右， 是已知的最小的抗原结合单位。这一特点使得其相对易于携带靶向药物进入细胞内部或穿越血脑屏障发挥作用。 （2） 单域抗体具有更好的溶解度和稳定性。传统抗体VH的FR2区域通常会包含数个相对保守的疏水氨

10、基酸， 利于与VL通过疏水相互作用结合， 但在VHH中这段区域常是暴露的， 因此这几个氨基酸被演化替换成亲水性的氨基酸， 例如， 在传统抗体的VH中第37位的Val、第44位的Gly、第45位的Leu和第47位的Phe/Trp等疏水氨基酸， 在骆驼科动物VHH中被相应替换为Phe/Tyr （aa37） 、Glu/Gln （aa45） 、Arg/Cys （aa45） 、Gly/Arg/Leu/Ser （aa47） 等相对亲水性更强的氨基酸7-8.这些氨基酸改变使得VHH在蛋白可逆折叠、热稳定性和抗蛋白降解等方面的性质相较于传统抗体更优。一些单域抗体可以耐受2.3–3.3 mol/L的

11、盐酸胍以及60–80的高温9.此外， VHH除形成Ig分子保守的FR1 （framework region 1, 框架区域1） 和FR3 （framework region 3, 框架区域3） 间的二硫键外， 还可能形成连接CDR1 （Complementaritydetermining region 1, 互补决定簇1） 和CDR3 （Complementarity-determining region 3, 互补决定簇3） 或者连接CDR2和CDR3之间的额外二硫键， 从而进一步提高VHH构象结构的稳定性10-12, 这些二硫键甚至可以让单域抗体不被胃蛋白酶和糜蛋白酶降解， 因

12、此有些单域抗体可以口服应用10. （3） 单域抗体的CDR3较长， 使其与抗原的结合方式更加灵活， 此种结构特征使得单域抗体可以结合抗原凹状的隐藏表位， 例如病毒的隐藏表位13和酶/受体蛋白分子的激活位点等14-15. （4） 与传统的鼠单克隆抗体相比， 骆驼单域抗体的免疫原性更小， 鼠源抗体与人源抗体的差异较大， 导致其免疫原性强， 一般需要经过复杂的人源化才能得到进一步的应用， 而骆驼抗体的VH和人抗体的VH相似度很高， 易于进行人源化改造和临床应用。2 单域抗体筛选方法2.1 基于噬菌体表面展示技术的单域抗体筛选噬菌体表面展示技术最早由Smith等在1985年发展出来， 该技术的核心是将

13、目的基因通过基因工程方法融合表达在噬菌体外壳蛋白基因中， 使其展示在噬菌体表面， 进而可通过特异性富集筛选获得携带有靶蛋白/多肽的噬菌体， 再进行克隆化和序列测定， 并最终获得靶蛋白/多肽的DNA编码序列。这一技术借助噬菌体的高扩增性， 将基因型和功能表型 （结合活性） 结合在一起， 是一种非常高效的筛选系统16.由于不存在传统抗体的轻重链匹配问题， 单域抗体更适合采用噬菌体展示文库技术进行筛选。噬菌体单域抗体文库一般分为三大类：免疫库、天然库和全合成库。免疫库是指从预先免疫过的动物 （如羊驼等） 体内通过特异性富集靶抗原特异的B细胞基因， 并扩增获得重链抗体VH基因而构建的单域抗体表达文库，

14、 通常只需较小库容即可筛选到高亲和力抗体。免疫库的受限因素在于免疫原的特征， 不同免疫原在动物中的体液免疫应答强弱和表位差异均可能影响最终获得抗体的质量和多样性， 最终筛选到的抗体同质化 （如识别的表位相同等） 程度较高。天然库是采用未经靶抗原免疫动物的B细胞扩增全部重链抗体VH基因构建的单域抗体文库。从天然库中筛选获得高亲和力单域抗体的成功率基本与库容成正比， 理论上只要所构建的抗体库库容和多样性足够大 （>10 CFU/m L） , 即可从中筛选到针对各种靶抗原的高亲和力单域抗体， 甚至是针对哺乳动物中高度保守的抗原 （类似自身抗原） 的单域抗体。尽管天然库已具有较高多样性， 但由于

15、在实际建库操作中， 会因抗体基因家族的偏向性、先天免疫耐受导致的克隆缺失等原因导致多样性降低。直接采用基因合成方法构建的合成单域抗体库可通过调节抗体分子中抗原结合区域附近的骨架区域来进一步提高库的多样性， 也可直接基于人源化的VHH分子骨架进行合成构建。Sandrine Moutel等新近采用全合成的方法构建了人源化的通用单域抗体库Na Li-H1, 库容达到3×10, 并从中成功筛选到若干针对不同靶标的高亲和力单域抗体 （k D达到10mol/L–10mol/L） 17.噬菌体展示技术筛选抗体的流程一般包括以下几点 （图2） : （1） 抗体基因片段的获取。取羊驼或鲨

16、鱼的外周血， 采用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞， 提取淋巴细胞的总RNA, 通过RT-PCR逆转录成c DNA, 采用巢式PCR两步法扩增VHH基因， 最后将VHH基因克隆到噬菌体载体上， 克隆构建完成后可用二代测序的方法来质控文库质量。 （2） 目的基因的淘选。先将噬菌体文库与不带有目的抗原的封闭液共孵育， 进行负选， 减少非特异性反应， 提高抗体淘选的效率。再将抗原固定到固相载体上 （聚苯乙烯板或者磁珠） 进行淘选。淘选一般要进行多轮， 每轮淘选后可采用Phage-ELISA检测， 直到能检测到明显的富集效果。 （3） 抗体的表达纯化， 将目的抗体基因序列克隆到表达载体上， 可以通过原核表达系统或真核表达系统进行表达。2.2 基于酵母表面展示技术的单域抗体筛选酵母属于真核的单细胞生物，