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1、你可能提过很多质粒 却不一定知道这些经常提质粒吗？熟练之后，提质粒乃至质粒构建都很简 单。但如果真问起一些质粒的细节，可能很多人回答不了。 不信随我看看。 质粒组成要素 一个合格的质粒含有以下组 成部分： 复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核 生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因 可以便于加以 检测，如 Amp+ 、Kan+。 多克隆位点 MCS 克隆携带外 源基因片段 P/E 启动子/增强子 Terms 终止信号 加 poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质
2、粒的类型（原核/真核/ 穿梭质粒）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什 么筛选标记。Ampr水解B 内酰胺环，解除氨苄的毒性。 tetr 可以阻止四环素进入细胞。 camr 生成氯霉素羟乙酰基 衍生物，使之失去毒性。neor（ kanr）氨基糖苷磷酸转移酶 使G41（长那霉素衍生物）失活hygr使潮霉素p失活。第 三步：看多克隆位点（ MCS ）。它具有多个限制酶的单一切 点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的 插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不 能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的
3、外源DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入， 越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元 件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与 表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是 要以实验目的为准绳。 启动子核糖体结合位点克隆位 点转录终止信号 启动子促进 DNA 转录的 DNA 顺序， 这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录 的部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子为真核 基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强
4、邻近基因 转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无 关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子负 增强子，负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列 （Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于 原核而言是AUG （起始密码）和SD序列。转录终止顺 序（终止子） /翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子 中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 downstream 有 一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly （ A ）加 尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的 保守序列，此位点 downstream 有一段 GT 或
5、 T 富丰区， 这2部分共同构成poly（ A ）加尾信号。为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA ,它的启动子等在其中一 条链上，而它的抗性基因在另一条链上。 如何选择载体 把 一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因 工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通 工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载 体（vector） P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA。 选 择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的 限制酶切位点。如果构建的
6、目的是要表达一个特定的基因， 则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述 3 点： 1. 构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合 适的克隆载体/表达载体。 2. 载体的类型： 克隆载体的克 隆能力据克隆片段大小（大选大，小选小）。如 表达载体 据受体细胞类型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载 体。 对原核表达载体应该注意 3 点：选择合适的启动子及 相应的受体菌；用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难 和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的 参考。 3. 载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不 同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错 位。 选用质粒（最常用）做载体的 4 点要求： 选分子量 小的质粒，即小载体（11.5 kb ）-不易损坏，在细菌里面 拷贝数也多（也有大载体）； 一般使用松弛型质粒在细菌里 扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒 必 需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； 必需有易检 测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr （试一试）。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后 采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得分子，以便 于与目的基因片段进行连接。
