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1、环介导等温扩增的评价用来快速检测丛枝菌根真菌食品科学与工程学院 生物工程 081 杨娟 2084308111在 2007 年 7 月 5 日投稿，2007 年 8 月 10 日收修订的通知，到 2007 年 8 月 28 日正式刊登， 2007年 9月21 日在网络上提供摘要对丛枝菌根真菌的检测和量化是对任何与共生菌相关的工作都是重要的。在这里，我们 应用环介导扩增(LAMP),等温DNA扩增技术，在体外条件下培养丛枝菌根真菌(AMF)。 环介导扩增技术第一次应用在丛枝菌根真菌，我们引用环介导扩增的底物，它能够扩大从胡 萝卜的根部移植来的丛枝菌根真菌DNA，和几个类群的丛枝菌根真菌提取的基因组
2、DNA (低至模板为 10-2纳克)。这项研究是再更具挑战性的环境条件下进行检测这种方法的新起 点。2007 年爱思唯尔有限公司保留所有权利。关键词：环介导扩增(LAMP)，丛枝菌根;血管球;检测;根定植正文丛枝菌根真菌(AMF)是无处不在的共生植物根系，它对陆地生态系统产生广泛的影响 (RiHig;2004)。对丛枝菌根真菌研究的一个必不可少的先决条件是他们可靠的检测，检测 也有很多方法(Vierheilig et al.,2005)。经常使用的技术大多是基于对真菌的代谢物或在根部 的真菌结构的微观评估的量化。已经有越来越多的兴趣在分子检测工具上(例如 .,Alkan et al.,2004
3、,2006) ,因为有区分和鉴定丛枝菌根真菌群的根内菌丝的可能性，其他的检测方法检 测范围有限。最近，定量检测丛枝菌根真菌与土壤和植物的共生体系的方法已经被提出采用 实时定量聚合酶链式反应的方法来检测。这种技术使得样品中大量的现有目标生物的量化具 有高的精确度和灵敏度。然而，这种方法的广泛应用是不可能应用在某些领域的比如生态学， 那些大量的样品可能带来很高的分析费用。因此，能够快速检测大量样品，又节约成本，简 单，快速的DNA扩增方法是必要的。最近快速发展起来的检测技术，环介导等温扩增DNA(LAMP)，是一个既有灵敏度和 速度，又相对便宜的一种方法。环介导等温扩增DNA依赖于利用具有链置换属
4、性的BstDNA 聚合酶促使DNA自动环化的DNA的扩增。环介导等温扩增DNA需要两个经特别设计的外 引物和两个内引物，可以使得扩增目标DNA具有高度的特异性，并且在等温条件下更快速、 高效。由于环介导等温扩增DNA是在6065摄氏度的等温条件下进行反应的，因此简单 的培养箱对DNA的扩增就足够了。环介导等温扩增DNA产生大量的焦磷酸离子，它可以 与反应混合物中存在的镁离子形成焦磷酸镁，一个白色沉淀的副产品(Mort et al.,2001 )。这 使得在视觉上能够快速和简便的鉴定通过环介导等温扩增的目标 DNA。环介导等温扩增DNA的方法很少被应用到土壤，根系或土壤生物，也没有应用到丛枝 菌
5、根真菌上。因此，我们目前的工作就是追求两个目标：大体上提高这种方法在土壤生态的 潜在作用上的认识和为了基于环介导等温扩增DNA用于丛枝菌根真菌的检测系统的发展奠 定基础。使用如前面过程所述的方法对丛枝菌根真菌 Glomus intraradices (DAOM 181602),G. intraradices (MUCL 43194), Glomus proliferum(MUCL 41827), Glomus lamellosum (MUCL 43195),Glomus celebriforme (MUCL 43208) and Gigaspora roseaNicolson and Sche
6、nck (DAOM 194757)的培养与胡萝卜毛状根的衍生的 Ri TDNA 有关( Gadkar ang Rillig,2005 ) 。 丛枝菌根真菌抱子通过凝胶剂的消融在分裂板上获得(Phytagel),使用10毫摩尔，PH为6 的柠檬酸盐缓冲液就可以被发现(1991)。从胡萝卜的根部移植双重培养的 G. intraradices， 有着不同的年龄和移植率也被使用。根染色(菲利普斯和海曼， 1970)和被移植的根的比生 长速率也被测定（纽曼，1966）。我们选择的 G. intraradicesB-微管蛋白基因（GenBank accession no.BE603903）去 设计环介导等
7、温扩增 DNA 的引物。引物的序列也通过引物探测 V4 软件程序深度分析（http:/primerexplorer.jp/e/index.html）然后设计环介导等温扩增 DNA 的引物:AMB-F3 （前内引物）、AMB-B3 （后内引物）、AMB-FIP （前外引物）、AMB-BIP （后外引物）。此外， 那个能够识别目标 DNA 模板链和反义链的每一个内部引物与 T 盒结合。引物定制合成。从 G.intraradices 单独的孢子分离得到的染色体组的 DNA 和前面描述的很像。同样用 Qiagen公司DNeasy试剂盒从胡萝卜根部提取的染色体组的DNA，移植并且控制。染色体组 的 DN
8、A 悬浮在缓冲液中。环介导等温扩增 DNA 扩大培养反应最后反应混合物体积 25 微升中包含了各 1.6 微摩尔 的 AMB-FIP 引物和 AMB-BIP 引物， 0.2 微摩尔的 AMB-F3 引物和 AMB-B3 引物， 1.5 毫摩尔的 脱氧核糖核苷酸， 8UBrt 聚合酶， 0.8 摩尔的甜茶碱， 4 毫摩尔硫酸镁和 2 微升提取的 DNA。 混合物在 60 摄氏度条件下反应 1 个小时。反应最有利的特点是可以生成可见的白色沉淀物。 为了进一步证明这个， 1 毫升 DNA 等分的用在 2琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色以观察 出可见的沉淀物。环介导等温扩增DNA引物是利用保藏的卜微管蛋
9、白基因来设计的，用来作为指定参数。 标记底物如 AMB-G1 可以在体外条件下培养被对来自培养的孢子的染色体组的 DNA 测定。底 物成功的以 的速度从模板上进行扩增。低于这个含量，我们可以得到特定的扩增目标。除了从孢子中获得的染色体组 DNA 之外， AMB-G1 底物的设置用来检测其是否能检测胡 萝卜中含有 G.intraradices 的可能性。从预先培养的体外根器官培养板中选取出年龄不同 的随机样本来使用。从一个高度移植的培养板中获取丛枝菌根菌根部移植大于 80%，而低和 中等水平的移植根样品移植率分别为5%-10%和25%-50%。丛枝菌根真菌-Gi的引物可以检测 从根样品（图 2）
10、的 G. intraradices intraradical 存在，但非殖民化的根源和阴性对照没有给出 信号。在早先的研究“（Gadkar和Rillig2005年）中，我们发现，被设计在G intraradices B -微管蛋 白基因上的 PCR 引物也可以用来扩增其他血管球杆菌，这意味着其保护 Glomeromycota 体 系（Corradiet al.,2004）。这也是丛枝菌根真菌-Gi环介导等温扩增DNA引物能够扩增目标产 物，其中包括一个 Gigaspora 隔离（图 2）。12345678910111 2 131415 M图二。应用环介导增温DNA引物进行扩增。第一列：intr
11、aradices DAOM 181602；第二列，G. intraradices MUCL 43194,第三列；G. proliferum;第四列，G. lamellosum;第五列，Glomus cerebriforme;第六列,G. rosea;第七，八和九列，分别从胡萝卜根部移植5-10%, 25- 50%,大于80%G. intraradices；第十，十一， 十二和十三列，分别是 G. intraradices 基因组 DNA1X10-1, 1X10-2, 1 X 10-3和1 X10-4纳克；第十四列：没有移植胡萝卜根和第十五列：空白对照。M： 100 碱基对的标记。为了比较环介导
12、等温扩增DNA和常规的聚合酶链式反应，用AMB-F3 （前内引物）、 AMB-B3 （后内引物）及常规的的聚合酶链式反应从抱子的基因组DNA或者胡萝卜根部扩增 B-微管蛋白基因，在丛枝菌根真菌-Gi环介导等温扩增DNA的引物设置中作为前内引物和 后内引物。循环参数如前面所述（Gadkar ang Rillig,2005）。在灵敏度方面。两种检测方法的 的目标是一致的，但采取完整的热循环的时间接近 3 小时，其中不包括琼脂糖凝胶的运行时 间和用溴化乙锭进行检测的阶段（图3）。相比之下，对同一样品的环介导等温扩增DNA反 应在1个小时之内完成，包括能够看见扩增成功的事件（试管中产生了白色沉淀，图
13、3）。图 3 环介导等温扩增 DNA 反应的形象产物（试管中的白色沉淀）和相应的用 PCR 来扩增从 G. intraradices抱子基因组或者才胡萝卜根移植来的B-微管蛋白基因（1a 1b），空白对照；（2a 2b）没从胡萝卜根移植；（3a 3b。从根处移植25-50%； （4a 4b。与3a 3b重复的；（5a 5b。从根处移植5-10%； （6a 6b） 与 5a 5b 重复；（7a 7b） G. intraradices 基因组（1X10-纳克）和（8a 8b）与（7a 7b）重复;M, 100 个碱基对标记环介导等温扩增技术已经被越来越多的用在了发病机制/医疗诊断研究中（e.g.,
14、 Savan et al., 2005; Fujino et al., 2005）;这项研究是第一次探索环介导等温扩增DNA技术的在菌根样 品中的应用。最近，汤姆林森等人展示了一个土源性致病真菌检测方法的有效性。例如，在 例行检查工作或土壤/环境样品分析时，当有机体需要被快速并且便宜的检测出的时候这种 方法可能特别的有用（关于基因副突变体， David-Schwartz et al., 2003 ） ，其中非常大的 样品容量对于统计学分析是很正常的(Klironomoset al., 1999)。因为那四种能够识别目 标 DNA 上六种不同序列的特别引物的应用，而不是像常规链式聚合酶中的两种引
15、物，环介导 等温扩增 DNA 具有极高的特异性，在一定程度上取决于引物的设计。而在这个概念验证研究中，我们仅仅注意了存在/缺失的检测，可能焦磷酸镁沉淀的浑 浊程度有关与模板输入量有关，从而使得该端点检测定量(Mori et al., 2001)。目前的 研究是环介导等温扩增 DNA 技术快速的检测用孢子或者在体外经过条件下高效控制的的移 植根获得丛枝菌根真菌的示范。环介导等温技术和我们发展起来的引物可能对在这些条件下 的筛选是有利的(Alkanet al., 2004).)。下一步应该包括检测在各种土壤或者从环境中 取得的根系材料这种挑战性的环境下的这里提到的方法或者引物的特异性。致谢这项工作的部分资金由副总统办公室研究的蒙大拿大学，柏林自由大学“ 和 USDA-CREES 出资。
