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1、海藻凝集素提取工艺材 料：孔石莼研究方法：正交实验法具体步骤：第一阶段实验(2011-12-1到 2011-12-10)一、样品处理1. 采集、洗净(过滤海水)、并把水吸干2. 冷冻3. 烘干：分30 C、40 C、50 C、60 C、70 C、80 C、90 C、100 C、110 C4. 研磨成粉(未使用时冷冻)二、凝集素粗提取液1.取样品 6g2. 按(质量体积比)1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 溶于含缓冲溶液 1： 0.15mol/L NaCl 的 PBS(0.015 mol/L，Na2HPO4NaH2PO4，PH 7.2)缓冲溶液 2： TBS (0.01m
2、ol/L, PH 7.2, Tris-HCl,含 0.15mol/L NaCl)3. 在缓冲溶液浸泡5、10、15、20、25、30、35、40h (过夜时用4 C)4. 离心( 4 C， 7000r/min， 30min)5. 取上清液 200ml三、凝集素提取的单因素试验分别检测烘干温度、液料比、缓冲溶液、浸泡时间等对凝血效价的影 响。第一阶段正交实验正交实验水平因素f因素水平、温度液料比缓冲液时间123正交实验表因素 实验号、.温度液料比缓冲液时间效果1234567891011第二阶段实验四、MNL硫酸铵分级范围的确定1、在冰水浴条件下，取 320 ml 粗提液平均分成 16份，分 别放
3、入16个小烧杯中。2、选择 10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、75 %、80 %、85 %、90 %, 16 个硫 酸铵分级范围进行盐析3、离心(4 C, 7000r min-i, 30min ),得到的沉淀物溶于适量的生理盐水中，用生理盐水透析至无 SO 2-，测 A 和凝 4280nm集活性。4、选择纯化倍数最高的盐析范围作为硫酸铵分级范围。对生理盐水充分透析。五、DEAE-52纤维素离子交换层析DEAE-52纤维素经处理后装柱，层析柱为1.6 cmX 30 cm，用 pH7.5,0.01 mol L-i
4、Tris-HCl 平衡后，样品 2 ml(大约含蛋白 70 mg), 上柱，用 pH7.5, 0.01 mol L-1 Tris-HCl 缓冲液洗脱至 A 0.01,280nm然后，梯度洗脱(A液为与300 ml平衡液，B液为300ml含有0.8mol L-1 NaCl的平衡液)，流速为18 mlh -1,每管3 ml, A 测定 280nm蛋白含量，对蒸馏水透析至无Cl-，用0.9%的NaCl的PBS(0.015 molL-1，NaHPO-NaHPO，pH 7.2)缓冲液反透析，用兔红细胞检测2424活性，收集有活性部分，透析、冻干得凝集素离子交换层析样品。六、Sephadex G-200分子筛凝胶层析ephadex G-200经处理后装柱，层析柱为1.6 cmX90cm，所上的样品为经过浓缩的离子交换层析得到的活力峰部分，洗脱液为含0.02% 叠 氮化钠 和 0.9% 的 NaCl 的 PBS(0.015 mol L-i , NaHPO-NaHPO , pH 7.2)缓冲液，流速 18 ml h -i，每管 3 ml。用2 4 2 4兔红细胞检测活性， A 测定蛋白含量。280nm七、蛋白含量测定用 A280nm 表示，以牛血清白蛋白做对照280nm第三阶段实验
