整理动物细胞培养技术

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1、动物细胞培养技术绪论局部1细胞的根本概念：细胞包括单个个体在体外条件下的生长,成为细胞培养.2组织培养：其本意是指从体内取出组织和细胞,模拟体内生理环境,在无菌,适当温度 和一定营养条件下使之生存和生长并维持其结构和功能的方法.组织培养从广义上说分为动物组织营养和植物组织营养两大类.组织培养常用术语贴壁依赖性：为细胞需贴附于第五或支撑物上才能生长的性质.细胞一代时间：单个细胞连续两次分裂的时间相隔,可借助显微电影照相术来精确确定.群体倍增时间：在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需时间.克隆；单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体,他们的遗传特性相同.原代培养：从体内取出细胞或组织的第一次培养.传

2、代或传代培养：不管是否稀释,将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶.细胞杂交：两个或多个不同的细胞融合导致一个含核体的形成.细胞培养：其本意是指从体内取出组织和细胞,模拟体内生理环境,在无菌、适当温度和一 定营养条件下,使之生存和生长并维持其结构和功能的方法.细胞培养的作用：在病毒学上的作用病毒的别离细胞培养在药物学上的作用新药的制备、药效的鉴别、病毒疫苗的生产、单抗的制备 细胞培养在肿瘤学研究上的作用例如化疗中的药物使用剂量、癌症研究等 细胞培养在细胞功能与分化研究中的应用；细胞培养在免疫学中的应用Harrison首先解剖出蛙胚原始脊髓节段进行培养.哈里森悬滴培养法.建立起一套合理的无菌

3、操作技术.淋巴一般皆公认Harris on为组织培养之父,凹玻片悬滴制备培养技术,对生物学知识的研究做出十分重要奉献.2 Carrel反复传代的方法使细胞系存活34年.他采用的无菌技术,以及后来设计的培养瓶卡氏瓶,Carrel flask等都是对组织培养的重要奉献.特别是他的连续培养,为后来的传代 培养奠定了根底.30年代传入我国,50年代逐渐开展细胞培养设施和根本条件一细胞实验室根本原那么：预防微生物污染和有害物的影响.和其它微生物培养不能在同一区域进行.净化工作室细胞培养实验室区域设置般分二区：无菌室、缓冲间、准备室一、准备室的主要作用消毒和培养物质的准备以及供给物品的保藏等.准备室内应有

4、的设备：水槽和盛物台、酸缸、水盆和桶、电炉和锅、物品准备台和水纯化装置、高压蒸汽消毒器、 电热枯燥消毒箱、储柜或储架.二、缓冲室1减少外界污染源带入培养室2应有消毒水、无菌衣和紫外灯或臭氧机三、无菌室操作室或培养室无菌室要求1培养室要密闭、无外窗2空气调节机要用中央风机3培养室的墙壁最好贴瓷片,墙壁要光滑无死角,地面可用水磨石或瓷砖4 装有紫外灯,天花板不宜高过2.5米无菌室应放置的设备：超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、真空泵或气泵、冰箱、杂物柜、小型低速离 心机.二超净工作台原理：鼓风机驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后,通过工作台面,形成无菌环境. 按气流方向可分为外流式和侧流式：

5、 外流式：净化的气流朝操作者方向流动. 侧流式：气流从上向下或从左至右流向对侧.使用考前须知：每三个月清洗一次粗滤网；根据情况更换除菌滤网；二、常用的大型必备装置和仪器1培养箱：二氧化碳培养箱,CO2培养箱设定的条件为 37C, 5 % CO2.使用CO2培养箱培养细胞时应注意： 用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气. 保持培养箱内空气干净,定期消毒. 箱内灭菌蒸馏水,也可参加防腐剂以保持箱内湿度,预防培养液蒸发2. 倒置显微镜：了解细胞生长情况,及时发现污染和污染类型.考前须知：在照明期间,注意不要触及灯泡和集光镜,不要将易燃物质靠近灯泡； 随时关闭电源3. 冷冻保存装置细胞培养中

6、常需储存细胞,常用的是液氮容器.液氮罐为双层结构,中间为真空层.内胆颈部与体部经焊接相连.总的来说,可分为窄颈瓶和宽颈瓶.使用时应考前须知：1、搬动和装入液氮时,要小心缓慢参加；2、由于液氮不断挥发,经注意观察存留液氮情况,及时定期补充,预防挥发过多而致细胞 受损.4. 冰箱-20 C.粉状培养基、消化酶、谷氨酰胺要贮存在4 C;血清、配制的抗生素、谷氨酰胺溶液等,需长期冷冻.如有条件,可配置-80 C冰箱5. 水纯化装置1自动双重纯水蒸馏器：2自动纯水仪双蒸器使用应考前须知：1使用时先开启冷却水水源.2、要调节去离子水或蒸馏水流速,使之进入一次横式烧瓶的速度根本上与二次横式烧瓶的 流出速度相

7、等.3、停用时应先关闭去离子水,再关闭电源,最后关闭冷却水.4、不可用普通自来水蒸馏.5、不宜使用存放数日的三蒸水.新购回的蒸馏器清洗方法：1自来水冲洗；2在1 %稀盐酸中浸泡24h,再用自来水冲洗；3用单蒸水涮洗数次；4安装好后,开始10min内蒸馏出来的水,舍去不用.蒸馏器清洗步骤：1、 移下冷却管,小心参加约 100ml浓盐酸到横式烧瓶内；2、半小时后,放出盐酸,自来水冲洗数次,去离子水冲洗后备用.6离心机一般1000rpm就可使细胞沉降,速度过大易使细胞损伤,实验室配置4000rpm国产离心机即可.7.pH计酸度计培养用的许多溶液要求 pH值7.27.48天平一般用电子天平配制溶液.一

8、般组织培养需配置一台小型的普通天平9. 高压蒸汽消毒装置：1大容量高压灭菌器 2全自动手提式灭菌器用于培养的培养器皿、三蒸水、一些培养用液、手术器材、胶塞等均需高压蒸汽灭菌.对于手术器械、培养器皿等物品在灭菌后要迅速使之枯燥.10. 电热枯燥箱温度范围在50300C ;主要用于器皿的枯燥及干热消毒.干热消毒160 C , 2小时,主要用于玻璃器皿消毒磁力搅拌器二、最常用的培养器具1. 过滤除菌装置：微孔滤膜滤器：滤膜的材料为混合纤维素酯,孔径有数种,常用有022微米和01微米两种.主要包括正压式不锈钢滤器和针头式加压塑料小滤器.可换膜式滤器有多种类型：a、正压式金属滤器又称筒式不锈钢滤器.2.

9、 手术器械作用：解剖动物,取材和原代培养中切割组织.手术刀柄及刀片、组织剪、虹膜剪、镊子、止血钳等.3. 培养器皿体外培养须使用大量的各式瓶皿.玻璃器皿选用透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成.塑料培养器皿的生长面带负电荷多为玻璃瓶,常用翻盖胶塞的盐水瓶,存放培养液、血清、试剂等.(2)培养瓶：有玻璃的和塑料的两种,培养瓶：胶塞,螺旋盖.胶塞用于密闭培养.培养瓶的结构：瓶口开口方向略朝上,与瓶身成一定角度培养瓶的规格一般指培养瓶壁生长面的面积或培养瓶的容积(3 )培养皿：主要用于盛放、处理、别离组织,也可用于集落形成的测定及单层细胞贴壁 培养等实验.(4) 多孔培养板：仅有塑料的一种.其规格有4孔

10、、6孔、24孔、96孔培养板.优点是节约样品和试剂,可同时检测大量样本.(5) 移液管和吸管：移液管为有刻度的吸管.吸管有直头和弯头两种.(6) 离心管：一般离心管.微量离心管(又称Eppendof管),规格有1.5ml、1ml、0.5ml等.(7) 其它器皿：如配制溶液的烧杯、量筒、漏斗、试管,消毒吸管用的消毒筒、以及冻存细胞用的玻璃安瓿 或塑料冻存管等.5. 特殊用具(1)筛网：金属或尼龙筛网两种材料.金属筛网又分为不锈钢网和铜网两种.筛网的规格有 目与 孔径两种表示方法.金属筛网有 150目(孔径为100呵)、200目 (74 m)、400目(40 m)等规格,尼龙筛网有孔径为 50 m

11、、75 pm、100 口以及250 E等多 种规格.细胞刮刀：细胞刮刀(cell scraper)用于将贴壁生长的培养细胞从培养瓶皿的壁上刮除下来.6. 杂用品试管架、培养瓶支架、微量加样器支架、酒精灯,小件用品包装消毒用的铝饭盒,密封瓶口用的各型胶塞,吸取液体用的乳胶滴头,耐压抽气胶管,玻璃器皿泡酸用的酸缸、抽滤装置等7. 洗刷装置：超声波清洗仪无菌制度1、 一般情况下细胞间每日消毒一次(包括缓冲间),方法为紫外线消毒(每次 30分钟至1小时)一次,另外每周用10%乳酸在紧闭门窗下熏蒸 30分钟；2、实验完毕应及时清理所用物品,注意台面整洁；3、及时清洗所用隔离衣,并高压灭菌后存放于指定位置

12、；4、 除实验必须的用品外,其它物品不得带入净化室；进入缓冲间必须更换指定消毒的拖鞋；5、人员流动：原那么为进出净化室应按次序开、关门,只有将前面翻开的门关闭后才允许打 开下一个门,使缓冲间起到应有的作用.作业题1. 常用的大型必备装置和仪器有那些？2. CO2培养箱、电热干烤箱、倒置显微镜和液氮罐使用考前须知？3双蒸器使用时操作步骤？4双蒸器使用一段时间后清洗步骤？5常用过滤除菌装置有那几种,筒式不锈钢滤器属于那一种.试述实验室设计原那么、方案和要求.培养室的功能、条件和要求.试述细胞培养的无菌环境.提问：常用的过滤除菌装置有那几种？筒式不锈钢滤器属那一种？鼓风枯燥箱使用时应考前须知？双蒸器

13、使用时应考前须知？1清洁液配置方法及考前须知 2甲醛产生气体的方法.3玻璃器皿,橡胶塞,橡胶管,金属器械,塑料制品,注射式滤器,培养瓶盖的清洗步骤.1、原代培养的概念及优点.2、解离释放细胞的方法有哪几种并说明其优缺点.3、提示需要更换培养液的因素有哪几点.4、如何实现悬浮细胞的培养清洗和消毒的作用：1 去除外表残留的有毒有害物质及微生物.2 改变玻璃外表性质.一、纯洁水制备1纯化水制备应考前须知：1纯化水装置应放在洁净、无尘、清静的地方.2贮在专用的玻璃瓶内,标记日期,最好随用随制.2纯化水的常用制备方法：1去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合2.超纯水装置制备纯化水去污剂的选择和使用：碱性去

14、污剂和浓硫酸洗液配合使用玻璃器皿的清洗有效清洗需考前须知：1 用后应立即浸泡；2.挑选适宜的去污剂；3 流水冲洗20次后,再用去离子水和重蒸馏水漂洗；4 洗后应及时晾干或烘干；5 包装后,放置干净处,待消毒.一玻璃器皿的清洗步骤1浸泡：新购置的 5%盐酸过夜.目的：软化和溶解附着物2. 刷洗：放在洗涤剂中反复刷洗.考前须知：1不留死角.2预防破坏器皿外表的光洁度.3用软毛刷.3. 浸酸:酸液又称清洁液,有强氧化作用.分类：强酸、次强酸和弱酸硫酸.不少于六小时,一般过夜.注意平安！4冲洗注满水-倒空或注入2/3的水后振荡冲洗 20次以上t蒸馏水冲洗 23次t 重蒸水一 次.二塑料制品的清洗清洗程序为：使用后立即流水冲洗t自来水过夜t用纱布或棉签和50 C洗涤液刷洗t流水冲洗t晾干t浸于清洁液中15分钟t流水冲洗 20遍以上t蒸馏水浸洗三次t双蒸水中泡24小时后冲洗t晾干.三金属器械的清洗新的：先用沾有汽油的纱布擦去油脂T流水冲净t酒精棉球擦拭t晾干.用过的金属器械立即用酒精棉球擦拭干净.四橡皮帽和橡皮塞的清洗新的：2%NaOH溶液中浸泡过夜t 流水冲洗,2%5%HCI浸泡30分钟t流水冲洗t去离 子水浸泡过夜或煮沸 20分钟.用过的可沸水处