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1、第十二单元DNA的复制和修复生物体的遗传信息储存在DN中，并通过DN的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自DN转录给RNA然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。1958年F.Crick提出中心法则：（1）以原DN分子为模板，合成出相同DN分子的过程。（2）以某一段DN分子为模板，合成出与其序列对应淋N分子的过程。（3）以mRN为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。DN生物合成有两种方式：DN复制和反转录。DN体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体
2、）病毒（双链，环状）。DNA的体外复制：分子克隆。一、DNA的复制（一） DNA半保留复制1953年Watso和Crick在提出DN双螺旋结构模型时就推测DN可能按照半保留机制进行自我复制。在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代DN与亲代DN分子的碱基顺序完全一样而且每个子代DN分子中有一条链完全来自亲代DNA另一条是新合成的。1958年Meselso和Stahl用1N标记E.coli.DNA，证明了DN的复制是半保留复制。1963年Cairn用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的.coli.染色体DNA泊-脱氧胸苷标记E
3、.coli.DNA，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli.DNA转至膜上，干燥，压感光胶片,3H放出B粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子,并以半保留的形式进行复制0DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。（二）复制起点、单位和方向DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。1. 复制起点复制起点是以一条链为模板起始DN合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。在一个完整的细
4、胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是DN呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含.T。复制起点的克隆和功能分析一一重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb勺重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有齐2个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小,最后得到245bp勺基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到20以上，这说明发动复制的序列住45bp勺基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段96bp勺DN片段上，与大肠杆菌的复制起始区有
5、86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。2. 复制单位复制子（Replicon）：Genom能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞IDN；都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制(一条链复制后才进行另一条链的复制。环状DN的复制眼象B,称B形复制。真核生物的染色体DN是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100
6、-200Kbp人体细胞平均每个染色体含有00(个复制子。病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。3. 复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的(等速进行或异速进行)，形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。用放射自显影实验判断DN的复制方向及速度，用低放射性H-脱氧胸背短期标记，再用高放射性常-脱氧胸苷标记，若为单向，一侧高，另一侧低。若为双向，中间低，两侧高。E.coli的一个温度敏感株，在42C时，能使DNA在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在25C时复制功又能能恢复。DNA的几种复制方式：(1) 直线双向复制：单点，双向，T7;多点，双向，真核染色他NA(
7、2) B型复制：环状双链DNA，单向或双向(E.coli)(3) 滚环复制：环状单链DNA0x174(4) D环复制：线粒体、叶绿体DNA(5)多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。在.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式OE.coli.DNA的复制最快可达50Kb/min完全复制需40min富营养时，20mir分裂。而真核染色体要6?8小时。二、与DN复制有关的酶及蛋白质因子目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNM制(一)DN的聚合反应和聚合酶DN生物合成5,-3，,化学合成3,-5，1. DN聚合反应必备的条件DNg1合幅DNA莫板(反转录时用RN模板)引物
8、(DNA、RN或蛋白质)4种dNTPMg2+2. 聚合反应过程及特点在链的延长过程中，链的游离3-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸x磷原子发生亲核攻击，生成3,.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。DN聚合酶的反应特点：以4种dNT为底物反应需要接受模板的指导，不能催化游离的NT的聚合。反应需有引物3-羟基存在链生长方向5，-3，产物DN的性质与模板相同3. 由DN聚合酶催化的几种DN聚合类型(1) 发荚环结构：加入单链)N作为模板和引物，3羟基端回折成引物链。(2) 末端延伸聚合：加入双链)N作为模板和引物，3末端突出作为模板。(3) 分枝型和切口平移型聚合：加入双链)NA聚合发生在切口或末端单
9、链区。(4) 环形聚合：加入带引物的环形DN作为模板。4. E.coliDNA聚合酶（1） 1）E?coli.DNApol.（Kornberg酶,400copy/cgll单体酶，Mr109Kd含一个ZrT,每个细胞中含40（个DN/pol.I，催化活性：5，3，聚合活性；3，-5，外切活性；5，-3，外切活性。用蛋白水解酶将DNApol.I部分水解可得：大片段（KlenoW75Kd活性：5，-3，聚合活性、3，-5，外切活性。小片段36Kd活性：5，-3，外切活性（只作用于双链）N的碱基配对部分，切除修复）Klenow片段的用途：a.补齐DNA3隐缩的未端；b.标记DN片段的未端；c?合成cD
10、N第二链；d.DN测序。（2） E.coli.DNAPol.11（100copy/cell）单体酶，分子量120Kd催化活性：5，-3，聚合（活性很低）；3,-5，外切活性，可能在DNA的修复中起某中作用。（3） E.coli.DNApcffi（复制酶，10-20copy/c0ll寡聚幅，全幅由1C种共22个亚基组成，a、&和B三种亚基组成核心幅。DNApol.E是合成新链DN主要的酶，又称复制酶Replicase），其5，-3,外切酶活性只作用于单链DNADN聚合酶有6个结合位点模板DN结合位点引物结合位点引物3-0显点、反应位点底物dNT结合位点5，-3，外切位点（pol.U没有）3，-5
11、，外切位点（校正）5. 真核生物DN聚合酶真核DN聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DN复制中起校正功能。DN聚合幅a,多亚基，可合成引物和DN片段，无校对活性，主要是用来起始链的合成。DN聚合幅B,主要在DN损伤的修复中起作用。DN聚合幅Y,从线粒体得到，可能与线粒体DN的复制有关。DN聚合幅S,可合成DN新链，有3-5,外切活力（有校对活性），功能与E.coli.DNApol.M相似，是负责DN复制的主要的酶。（二） 引物酶或RN聚合酶（引发酶）细胞内，DN的复制需要引物（DN或RNA,弓i物幅或RN聚合幅可合成6-10个碱基的RN引物。DN复制为什么要用RNAI物？为什么DN聚合
12、酶要用引物，RN聚合酶不需要引物？从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配；新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链,DN聚合酶的5,-3,校对功能难发挥作用。（三） 解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋幅I、U、川与ep蛋白共同作用，将DN两条链解开。解螺旋幅、II、III沿着模板链的5-3方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3-5方向移动。（四） DN旋转酶属DN拓扑异构酶U,可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物。拓扑异构酶I使DN的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在
13、活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶n使DN的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由T供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。（五） 单链DN结合蛋白（SSB复制叉上的解螺旋酶，沿双链）N前进，产生单链区，大量的单链）N结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DN不被核酸酶降解。（六） DN连接酶（ligase）连接双链DN上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接）N缺口。TQNAligase即可连接粘性末端的DNA又可连接平齐末端的双链DNAE.coli.和其它细菌的DNAligase以NA为能源，动物细胞和噬菌体DNAligase以AT为能源。三、CNAS制的拓扑结构D
14、NA复制时，超螺旋结构和双螺旋结构的解开由DNA拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白协同作用完成。四、DNA勺半不连续复制DN的半不连续复制DN聚合酶催化的方向是5,-3,新合成的两条链有一条是连续合成的，称前导链，另一条链称滞后链，先延着与复制叉前进方向相反的方向，有-3,方向合成短片段即冈崎片段，随后又连接酶连接成完整的链。冈崎片段的长度：细菌为Kb-2Kb相当于一个顺反子的大小。真核为10旷200bp约等于一个核小体DN的长度。五、原核生物DN复制过程（E.coli.）1. 复制的起始引发：当DN的双螺旋解开后，合腑N引物的过程。引发体：引物合成幅与各种蛋白质因子（dnaBdnaGn
15、、nznl）构成的复合体，负责RN引物的合成。引发体沿着模板链53方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发引物的合成。E.coli.DNA复制原点oriC,由245bpfi成，三细3bp重复序列（近5,端处），四组9bp重复序列（另一端处）。大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质DNaA在原点处打开双螺旋DNaBDNaCDNaB结合在原点所需使DN解旋Hu弓I物幅（DNaG合成RN引物刺激起始SSBRN聚合前促进DNa活性旋转幅松驰DN扭曲应力结合单链DNA20个Dna结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DN环绕此复合物三组13bpt复区依次变性，产生开放型复合物。DnaB（在Dna协助下）与开放复合物结合，进一步解链。2. DN链的延长反应前与链只需要一个RN引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RN引物，链的延长反应由
