第五章 核酸的分离纯化

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1、第五章 核酸的分离纯化核酸分离纯化的原则:保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度DNA 与 RNA 在分子大小、理化性质等方面不同分离方法存在差异。DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研 究对象DNA和RNA的分离与纯化技术是分子生物学研究中重要的基本技术。 核蛋白：核酸+蛋白质DNP： DNA+蛋白质RNP： RNA+蛋白质第一节 核酸分离纯化的设计及原则（一）材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、 产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案（二）选择原则1. 保持核酸碱基序列的完整性2. 尽量清

2、除其它分子的污染，保证核酸纯度3. 保持核酸的完整性尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏二、技术路线的设计（一）核酸的释放DNA 和 RNA 均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即 是裂解细胞、释放核酸。套I割破附川丿; M/JIII机械法1匀浆法 z捣碎法 3研磨法机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母II物理法反复冻融法3冷热交替法4低渗裂解细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞m化学法1有机溶剂?去垢剂3酶解法细菌、酵母 组织、培养细胞 细菌、酵母（二）核酸的分离与纯化应该清除的杂质主要包括：1非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖及脂类物质等2

3、非需要的核酸分子分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质3.加入的有机溶剂和某些金属离子（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸最常用的方法常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定1浓度鉴定（1）紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。广psi翳嚼220240260280300 320niriDNA或RNA的定量OD26O=10相当于：50 n g/ml 双链 DNA40ug/ml单链DNA

4、 （或RNA）33 u g/ml寡核苷酸适用于0.25 u g/ml的核酸溶液（2）荧光光度法：A:溴化乙锭（EB）核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV 激发下发出红色荧光。凝胶电泳中荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。 该法灵敏度可达Ing5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。注：溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。使用时必须戴手套操作。B、Sber Green I与dsDNA亲和力较高，结合后荧光强度大大增强，特别适用于对溶液dsDNA 的检测、分析。特点为：灵敏度高，至少可检出20pg dsDNA分子。高于EB 25100倍。受ssDNA、RNA及其他物质

5、的影响小。对Taq酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶没有抑制作用。C、GoldView（GV）GoldView（GV）作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。GoldView（GV）是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，使用方法与 之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5pl GoldView即可。在紫外透射 光下双链 DNA 呈现绿色荧光，也可用于染 RNA。通过 Ames 试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色 体畸变试验，致突变性结果均为阴性。通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割 DNA条

6、带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、 转录等分子生物学下游操作的效率。虽然未发现 GoldView 有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作 时应戴上手套。2. 纯度鉴定（ 1）紫外分光光度法：主要通过 A260 与 A280 的比值来判定有无蛋白质等的污染。比值升高或 降低均提示制备的核酸纯度不佳。判断核酸样品的纯度DNA 纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA 纯品: OD260/OD280 = 2.0（1.82.1）当 DNA 样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响 DNA 吸光 度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260

7、、OD280，计算其比值 来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA： 0D260/0D2801.8（1.9,表明有RNA污染；V1.6,表明有蛋白质、 酚等污染）纯RNA： 1.7 V0D260/0D280V2.0 （V1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0 时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可 使用其他方法进行估算。另外，鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响A260/A280的读数。如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris缓冲液（pH 7.5）中的读数低0.20.3。 荧光光度法：EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯

8、度。3. 完整性鉴定琼脂糖凝胶电泳：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度咼沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 28S （或23S） RNA的荧光强度一般约为18S （或16S） RNA的2倍，否则提示有RNA的降解若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染（二）核酸的保存1. DNA的保存溶于TE缓冲液中的DNA在-70C冰箱可保存数年。TE的pH值为8.0时，可减少DNA的脱氨反应； 低于7.0时DNA容易降解。EDTA:螯合M

9、g2+、Ca2+等可抑制DNA酶的活性；低温保存：-4 C ； -20 C ； -70 C加少量氯仿：有效避免细菌与核酸的污染。2. RNA的保存RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70C保存RNA溶液中加入RNasin或VRC,可延长保存时间用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理第二节真核基因组DNA的分离纯化哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线有机溶剂抽提离子交换层析纯化乙醇沉淀洗涤PFGE:脉冲场凝胶电泳法 一、酚抽提法1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNa

10、se的裂解缓冲液裂解细胞Cell extractMix with phenolISeparate layers by aentrifugation经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品Aqueous layer (DNA+RNA)Interface (coagulated proteins)Phenol细胞裂解液20ml 细胞裂解液20mmol/L EDTA ,100 mmol/L Tris,pH8.0, 0.8%(W/V)SDS给出的摩尔浓度都是终浓度，W/V为质量体积比，知道了所要配制液体的体 积，就可以根据它给出的浓度算出所需要的摩尔数以及其质量，比如说要配

11、 制 20ml 的裂解液，所需每种成分的质量如下：EDTA: 0.02LX 0.02mol/L X 372.5g/mol=0.149gTris: 0.02LX0.1mol/LX 121.1g/mol=0.2422gSDS: 20X0.8/100=0.16g将0.2422gTris溶于蒸馏水中，调节其PH值为8.0,然后加入0.149gEDTA和 0.16gSDS,即为所要的裂解液苯酚/氯仿提取 DNA苯酚/氯仿提取 DNA 是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质 变性，SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消 化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使 DN

12、A 从核蛋白中游离出 来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容 易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到 水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离 心后有机溶剂在试管底层（有机相），DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀 于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与 有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水 乙醇在1/10 3mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA 沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解D

13、NA备用。Tris中文品名: 三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 缓血酸胺英文品名: Tris; Tris（Hydroxymethyl）aminomethane英文别名: 2-Amino-2-（hydroxymethyl）-1,3-propanediolSDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与 蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS 能与蛋白质结合成为R-O-SO3-R +-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀 下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须 把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA

14、时）受到干扰。例：培养细胞DNA提取1.贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。2， 细胞重悬于冰冷的 PBS 漂洗一次，离心收集。3， 重复 2。4，加入5ml DNA提取缓冲液,（10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, 0.5% SDS）, 混匀。5,加入25ul蛋白酶K，使终浓度达到100ug/ml,混匀，50C水浴30min,6， 用等体积的酚抽提一次， 2500r/min 离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次， 2500r/min 离心收集水 相。用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。7, 加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min

15、.8, 2500r/min,离心10min.转上清与一离心管中。加入等体积的异丙醇。室 温10分钟。9， 2500r/min,离心10min。弃上清。加入0.1倍 体积3mol/L乙酸钠（PH5.2） 与2倍体积-20C预冷无水乙醇。-20C 20分钟。10，12000r/min,室温离心5分钟。弃上清。将DNA溶于适量TE中。为什么用无水乙醇沉淀DNA?用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的 优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无 水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用 95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵）。但是加95