目的基因克隆

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1、目的基因的克隆摘要基因克隆是经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。本实验以水稻基因为模 板，通过PCR扩增出1.0bp左右的片段，用SacI、KpnI将片段进行双酶切，与pUC18 载体连接获得重组子，将其转化到大肠杆菌感受态细胞中并提质粒酶切验证进行筛选 鉴定。关键词：基因克隆；扩增；连接；转化；酶切1引言蛋白激酶催化的蛋白磷酸化和蛋白磷酸酶催化的去磷酸化作用在植物细胞感受 各种环境信号及其信号传导与放大过程中起着重要作用，其中促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的作用受到广泛重视。本实验旨在筛选并鉴 定出水稻MAPK的阳性

2、克隆。2材料与方法2.1实验材料2.1. 1试剂和缓冲液Tag 酶，10XPCR Buffer，dNTPs，弓I物，模板，琼脂糖，漠酚蓝，TE，TAE，EB， DNA marker，质粒，SacI，KpnI，无菌水，乙醇，NaAc，T4 连接酶，E.coli，CaCl2 (灭 菌)，LB固液体培养基，氨苄青霉素(Amp)，溶液I，溶液II，溶液III，70%乙醇。2.1.2仪器耗材PCR仪，掌上离心机，枪头，1.5mL离心管，PCR管，冰盒，电泳仪，电泳槽，凝 胶成像仪，移液枪一套，微波炉，水浴锅，灭菌锅，Tip，eppendorf管，控温摇床 (37C)，冷冻离心机，冰箱(-20T、-70C

3、)，超净工作台，培养箱(37C)，分光光 度计，三角瓶，6cm平皿，酒精灯，三角玻棒，酒精棉球，火柴，制冰机，试管，培 养皿，试剂瓶，超净工作台。2.2实验方法2.2.1目的基因的获得按如下反应体系加入下列各成分:模板 DNA (5ng/gL)0.5gLPrimer10.3gLPrimer20.3gL10XPCR buffer1.5gLdNTPs (2.5mmol/L)1.2gLTaq 酶(5U/gL)0.3gLddH2O10.9gL总体积为15p L,混匀后，加入10p L石蜡油覆盖，然后按以下程序进行扩增:94 C2 min94 C0.5 min60 C0.5 min28 cycles72

4、 C1J1 min72 C8 min4Chold反应结束后取出PCR反应管，纯化PCR产物（将PCR产物加入H O补足体积至 2100. L，然后加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH5.2）溶液，再加2倍体积的无水 乙醇，-20C，沉淀DNA。12000 rpm/min 4C离心15min，弃上请，加70%乙醇洗沉 淀物，再离心，弃上清，干燥加10 M LddHO溶解）的同时用1%的琼脂糖凝胶电泳检2测PCR产物（取PCR产物2. L与上样缓冲液混合，点样），电泳结束后，漠化乙锭染 色5-10分钟，用凝胶成像仪观察、拍照。2.2.2载体和目的片段的酶切2.2.2.1载体和外源DNA的

5、酶切按如下反应体系加入下列各成分：反应体系12 gL5 gL0.5 gL0.5 gL质粒(20ng/pL)bufferSacI (10U/gL)Kpnl (10U/gL)ddH2O42应反应体系2PCR 产物(50ng/pL)10应buffer10gLSacI (10U/gL)0.5gLKpnl (10U/gL)0.5gLddH2O79gL37C酶切2至4个小时，65C, 10分钟终止反应。2.2.2.2电泳检测取10gL质粒载体酶解液，电泳检测。PCR产物酶切后不必电泳检测，直接回收 即可。2.2.2.3酶切片段的纯化及回收将酶解液加入H2O补足体积至100gL，然后加入1/10体积的3mo

6、l/L的NaAc (pH5.2)溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20C，沉淀DNA。12000 rpm/min 4C离 心15min，弃上请，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，弃上清，干燥加4 gLddH2O溶解。2.2.3 DNA重组技术质粒酶切产物 4PCR酶切产物 4T4 ligase110xbf1H2O3Total10 gL16C连接 4-5h。2.2.4大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化2.2.4.1感受态细胞制备1. 第一天：从大肠杆菌TOP10平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基 的试管中，37。振荡培养过夜。2. 第二天：取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB

7、液体培养基锥形瓶中，37C 振荡培养。2-3 h，测定OD600 M 0.4-0.5，细胞数务必108 / mLo （此为实验成功的 关键）3. 将菌液转移到50 mL离心管中，冰上放置10 min。4. 离心10 min，4000r/min，4C，倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽， 回收细胞。5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 10 mL悬浮沉淀，立即放在冰上30 min。6. 4C 6000 r/min，离心 10 min，回收细胞。7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2 mL悬浮细胞，务必放在冰上。此细胞为感受态细 胞。8. 分装，每管200应。可以加入15%

8、甘油-70度保存。2.2.4.2质粒转化1. 取200 pL新鲜制备的感受态细胞，加入连接产物10pL （50 ng ）混匀冰上 放置30 min。同时作2个对照管：对照1： 200 pL感受态细胞+ 10pL无菌水（不含氨苄皿）对照2： 200 pL感受态细胞+ 1pL标准质粒DNA溶液（50ng/pL）2. 将管放到42 C循环水浴90-120sec。3. 冰浴2 min。（提前准备好）4. 每管加600 pL LB液体培养基，37C培养1 h （慢摇）。5. 将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。注意对 照2离心后涂10-50pL。（提前倒好平板）6. 倒置平皿37

9、C培养12-16 h，出现菌落。7. 计算阳性对照的转化效率，记录样品的转化子总数。2.2.5重组克隆的筛选与鉴定1. 从实验四获得的平板上，挑取单克隆，加入含有3mL LB+Amp100的试管中， 37 C振荡培养过夜。2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min离心2 min。注：剩余培养物放置4C，用于保菌。3. 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4. 将细菌沉淀悬浮于100 pL溶液I中，充分振荡混匀，室温放置5 min。5. 加200 pL溶液II （新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物，将离心管放冰上 5 min 。6. 加入150四L溶液III（冰上预冷）,盖

10、紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置5 min。7. 12000 r/min，离心15 min，将上清转至另一离心管中。350四L8. 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，10000 r/min, 离心10 min，将上清转移到另一离心管中。该步骤可以不做。9. 向上清加入2倍体积乙醇700四L，混匀后，室温放置15-30min。10000r/min 离心10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸十液体。10. 用500四L 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽 十或空气中干燥。11. 加入适量（20-50四L）的无菌水，室温使DNA完

11、全溶解，-200保存。12. 取2四L质粒进行双酶切，酶切体系如下：10xbf 2四L，限制酶各0.5四L，H2O 15应。37 度，2-4hr。13. 1%琼脂糖凝胶电泳检测。3结果与分析3.1 PCR扩增产物检测结果以水稻DNA为模板，经PCR扩增和电泳检测，获得大小约1.0 kb的特异性片段 （图1），与目标基因的片段大小（1059bp）相吻合。13M1000 bp图1 PCR产物电泳图3.2质粒酶切检测结果将质粒载体PUC18进行双酶切，电泳检测，获得大小约4.5kb的片段（图2）， 结果正确可以进行连接。5000 bp3000 bp3.3转化子总数和转化频率将连接产物转化到感受态细胞

12、中，13组含氨苄的平板上转化数为40个。依据两 组对照计算转化子总数和转化频率：转化子总数二菌落数X稀释倍数（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）=7.7 X104转化频率（转化子个数/每ug质粒DNA）=对照2转化子总数/质粒DNA加入 量（ug） =60 X转化数/10X 10-3=60X8/10-2=4.8X1043.4酶切验证检测结果重组子经单酶切后片段大小应为5.5kb左右，可本组电泳检测却显示重组子单酶 切片段与质粒单酶切片段大小一致（图3）,推测失败可能原因是目的片段与质粒载 体连接时出现问题，转入大肠杆菌的是自连的质粒；但是其它做双酶切组挑取的克隆 是本组的单菌落，并且双酶切正确

13、，所以还可能是酶切体系有问题。Z M5000 bp图3单酶切验证电泳图4讨论基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为：分、切、 连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲 克隆的目的DNA； “切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的 基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分 子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增； “选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。近年来，植物中MAPK级联及其功能已有不少研究，分离鉴定了几十个编码MAPK 的基因，并发现大多数MAPK参与激素应答、环境胁迫反应以及植物抗病反应。在植 物抗病反应的调控方面，发现MAPK可以参与抗病基因介导的抗病反应、过敏性反应 中细胞死亡以及植物的先天性免疫性，并且证明拟南芥的MAPK级联 MEKK1-MKK4/5-MPK3/6是先天性免疫抗病性所必需的。本实验利用已知引物扩增出水 稻MAPK基因，对其在水稻生长发育以及抗逆性反应中的作用的研究打下基础。5结论以水稻基因为模板，通过PCR扩增出1.0bp左右的片段，计算转化子总数为7.7 X104，转化频率为4.8X104,但最终酶切验证错误。