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1、毕赤酵母表达系统的构建1. 确定转入的目的基因，并设计相应引物，进行PCR反应，获取目的基因片段。（所需药品-高 保真酶，引物，dntp，胶回收试剂盒。）2. 对目的基因及载体Ppic9k进行酶切产生粘性接头并纯化回收。（所需药品-Sall、StuI、SacI【用于于GS115产生His+Mut+】； BglII【用于于GS115产生His+Muts】）酶切体系酶切体系50 |iL目的。置10 pL酶切缓冲液5 pL限制性内切酶1 pL超纯水34pL37 酶切1 4小时。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。(3 )提取质粒进行PCR及酶切检测并送交测序。(pPIC9k测序时，用a-factor
2、弓|物及3AOX1测序引物。将引物重悬于20ul灭菌水中，制成0.1ug/ul溶液) 4在0.85ml过夜培养菌液中加入0.15ml灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入标记好的储存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70度保存。5测序证实结构正确后，可准备转化DNA5. 毕赤酵母电转化：细胞准备:毕赤酵母感受态制备：(1 )取1 mL GS115过夜培养物(OD6006 . 0 - 10 . 0)转接于100 mL YPD液体培养基中28C-3OC、250300 r / min培养至酵母菌的对数生长期(OD600 1 .0-1.3)(2 )取此菌1 mL分装到1.5 mL EP管中，4
3、C、10 000甘离心1 min，弃上清 液，沉淀用无菌水(4C预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。(3 )加入 1 mL处理液【10 mM LiAc、10 mMDTI、0 . 6 M sorbitol、10 mM TrisHC1(pH7.5)】，室温下放置20 min。离心，弃上清液。(4 )加入1 mL 1 M sorbitol ,离心，弃上清液，用1 M sorbitol洗涤二次，到最 终体积约为80微升，冰浴中保存或一70C保存待用。转化：1取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA (溶于5-10ulTE )混合，转入预冷的0.2cm电 转杯中。2在冰上放置5min3根据所使用装
4、置推荐的酿酒酵母参数进行电击4立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中5分成200-600ul等份，涂于MD或RDB平板上6在30度孵育平板至克隆产生，筛选Mut+/Muts表型6. 遗传霉素抗性转化子开始前：准备10个YPD平板，每个的遗传霉素浓度为0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5,1.75, 2.0, 3.0 及 4.0mg/ml。1吸取1-2ml灭菌水于所有HIS+转化子平板上2用灭菌刮子重悬HIS+转化子，不要划破琼脂3将细胞悬液集中转移至灭菌的50ml离心管中，稍涡旋(5-10S)4用分光光度计测定浓度(1OD600= 5X 107细胞
5、/ml)注意：混有琼脂会干扰读数5在每块含有遗传霉素的YPD平板上涂105细胞。(需要证实在没有遗传霉素的YPD板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗 传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转化子稀释到10_5, 10-6, 10_7浓度，每板加100-200ul）6在30度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5天出现，不含遗传霉素的YPD平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。P39注意：如果在以上方法里你将所有细胞都悬浮，加15%灭菌甘油，存于-80度，可在以 后时间里做遗传霉素抗性筛选。7.筛选Mut+及 Muts转化子（1 ）
6、将上一步获得的转化子用灭菌牙签挑取单克隆，在MM及MD平板上以一定的方式划线或 点HIS+转化子，确保先在MM平板上点（2）每个克隆换一次牙签，点100个转化子后再继续向下做（约2-3板）（3）为分离Mut+ 及Muts表型，在MD及MM平板上各点上对照（GS115/HIS+ Muts Ablumin及 GS115/ HIS+ Mut+ Qgal）（4）30度孵育2天（5）两天后，计数平板，寻找在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌 株。3.将酶切正确的目的片度与质粒相连（所需药品-连接试剂盒Solution 1宝生物）载体 DNA0.5pL目的片段DNA4.5pL连接试剂盒Solution I3 4 5 PL充分混匀，置于16 连接4 h或4 C连接过夜。4.转入DH5 a扩繁质粒（所需药品-Amp； DH5a ； CaCl2 ）将DNA目的片段和载体的连接产物与200pL感受态细胞混匀，冰浴30min。45C热击45-60s , 冰浴3min后加入800pL LB液体培养基37 C震荡培养1h。（1 ）转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul Amp的LB平板上，选择Amp抗性克隆（2 ）挑取10个Amp抗性转化子，接种含150ug/ul Amp的培养基，37度振荡培养过夜
