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1、DNALADDE检测细胞凋亡的讨论例一gongyulai：我用的是药物诱导癌细胞凋亡，做DNALadder（用的是北京鼎国的动物细胞凋亡梯子提取试剂盒）。跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象，Marker到是出来了。我是按说明书上0。8%的琼脂糖。我用的是60v电压。不知道什么原因？郁闷。说明书上说混合温和是什么意思，我又没用力摇。我还想问收集凋亡细胞时离心时转速多少比较好？chujun_hust：（1）“跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象”：可能是由于你点样时，时间太长了，导致样品扩散；还有一个原因是你设置的电压太高，最好是24v/cm，跑46小时比较合适（2）“我
2、是按说明书上0。8%的琼脂糖”：凝胶浓度太低了，把凝胶浓度加大到2，放心做，没问题的（3）“说明书上说混合温和”：那是怕你混匀太剧烈导致细胞基因组DNA断裂啊，注意很轻轻的混匀（4）“收集凋亡细胞时离心时转速”：我在实验室中是5000rpm，离心5min，我觉得足已mmyycc：我的ladder总是只有一条带，与对照组差别不大，用的是100v,1-1.5h,不知道是不是这个原因？溴酚兰跑到什么位置合适呢？chujun_hust：电压设置太高了啊，溴酚兰一般跑到蓝色离胶顶2cm左右吧。附上我刚刚做的DNALADDER图象，我用的不是试剂盒，是按照细胞实验指南上做的，效果不错啊具体见：http:/
3、 (1)我的早先的回答并不很准确，我问一位长江，他的解释是与凋亡程度无关，而是同一timepoint凋亡的细胞数有关，就是说其他检测方法检测到再多的凋亡细胞也不一定能用常规方法跑出ladder(3HTDR/biotinlabel除外)，例如tunel法观察到大量的凋亡细胞而ladder没有的原因，因为他们不是集体自杀：)而是断断续续的自杀，小片段很多都降解了。很多protocol都是基于大量细胞接受凋亡诱导试剂的统一作用才能跑出ladder；我不敢说那种最好，但只有两种我作出来了，小分子片段选择性抽提和上文所讲到的方法，想来就是细胞没有大量同时凋亡。其中后者结果更好，但小片段抽提我也跑出来了，
4、方法是和流式细胞术处理凋亡细胞的方法是同源的，就是：3) 1)细胞(组织适度匀浆)80%乙醇固定过夜224h(室温4。C);2)800g4。C离心5min;hanks平衡液洗涤重悬；再离心；加入(192ml0.2mNa2HPO4+8ml0.1mol/L的柠檬酸pH7.8)混合液室温30min以上，间或摇匀，离心取上清，冷冻抽真空浓缩；(剩下的细胞PI染色还可以跑流式细胞仪测凋亡亚二倍体)0.25%NP40,Rnase37C30min(3ul?多加点没关系)蛋白酶K37C30min(3ul?多加点没关系)再浓缩浓缩6xloadingbuffer混合根据小片段液量自己选择(610ul)0.5xTB
5、E里跑电泳注意：DNA别降解了，混匀时tip头口剪宽一些，组织要多一些。另：你们问我如何避免样品溢出，好像溢出不多啊，一丝一缕而已，至少我的ladder跑得出来，就把胶放在电泳槽里后再加TBE吧，不至于全流出来吧，还有就是用6X的loadingbuffer,可能可以增加比重，这也是书上的做法。要不把胶的孔做深点？chujun_hust：（towscoco78）看了您的帖子，我觉得还是用黄培堂编译的那本细胞实验指南（冷泉港）上写的方法去做，我昨天晚上完全按照上面的配方和步骤进行DNALADDER分析了！在做的过程有一些问题，想请教您！（1）对于贴壁细胞是不是需要把漂浮细胞和贴壁细胞（胰酶消化）一
6、起收集，离心，然后进行裂解分析啊？（2）在配制细胞裂解液后（我这次是把EDTA,Tris-base,SDS放在一起搅拌混匀的，SDS溶解了），使用pH试纸测得其pH值大概在8.0左右啊，好像根本不需要加HCL调pH值啊？您在配此溶液的时候是不是也是这样啊？注：书上的配方中写的是100mmol/LTris，pH8.0，而不是100mmol/LTriscl，pH8.0，我想大概是不需要加HCL的了，不知道我的理解对不对？（3）加入20ul裂解液后，发现用移液管尖很难将细胞混匀啊，起了很多的泡沫啊，很且很粘稠？不知道怎么才能混匀啊？（4）加入蛋白酶K后，溶液立即出现絮状白色物，不知道是何东西？（我现
7、在是用未任何处理细胞做的）（5）不知道在哪些步骤使用宽口吸头，比较合适？（6）书上写的是RNA酶A/T1混合液，我没有T1，只有Rnase（不知道是不是RNA酶A？），不知道是不是可以？（7）全部完成后，我暂时不想电泳，不知道是不是可以放在-20度冰箱中保存，过几天再跑电泳啊？另：不知道您参考黄培堂编译的那本细胞实验指南（冷泉港）的方案后，是完全按照上面做的，还是有修改?wscoco78：sorry！chujun：（1）我不知道你的情况，但既然都是培养细胞，自然都要拿来裂解，才能反映群体的凋亡情况;（2）8.0就好，裂解液的配方多得去了，有这几种基本成分就行了，还可以加tritonx100，只
8、要你的试剂好（fluka、amresco、sigma），照这些经典基本上都不需要调pH值，真的很准，上下0.5而已；你的理解经我实践是对的：）（3）把枪尖浸入液面下，部分按下按钮，只是形成暗流，在液面下涌动，气体不放出来自然无气泡啊；（4）蛋白酶K是冷的吧，加到50。C的裂解液自然会出现絮状物，再涌动涌动（同上）就消失了，不是什么怪现象；（5）混匀时都用剪过的枪头吧（剪刀用酒精灯火焰过一下），加东西时就不要用了，以免影响液体量准确性；（6）我也没有：）只要是Rnase就行，那只是用来消灭5s的，没那么重要；（7）可以。我就是把裂解液里多加了tritonX-100，因为俺要做组织的，再就是裂解时
9、间更长些，overnight也不怕，6xloadingbuffer多加些，比重增大，不会被bufferflushout，再就是冷冻抽真空浓缩到100ul以下。你的细胞我看可以更少些，5060ul？总体上就是该粗的就粗，该细的就就细。wscoco78：肯定会做出来的，我上次马虎，把热的样品直接拿去抽真空，沸腾出来许多，剩下一点还是出来ladder，唉，我都佩服自己了：）你最好选择24V/cm电压，用大的电泳槽（10cm以上），电泳过夜，当然别跑出去了，我是这样做的。chujun_hust：我看了很多文献，好像文献中琼脂糖凝胶的浓度好像有很多种啊（比如1.5%,1%,2%）不知道哪一种效果最佳啊？我的样品最终大概有50ul左右吧，不知道点多少在孔中比较合适？我这边的电泳槽最大的长度（阴极和阳极距离）为23cm，你说过夜，会不会跑出去啊？你电泳时间大概多长啊？wscoco78：用0。8都跑得出，当然是ladder的靠上部分，一般不要低于1。5，用1。6吧，我用的1。5，但还不够理想，看来是要大一些。样品每孔我加20ul以上；照2v3v/cm应该不会跑出去，你的长度也不会，就9个小时左右吧，你有手持的UV-detector吗？隔一段时间暂停电泳，照照看。做吧，只有在电泳中才能学会电泳。midas:（TOwscoco78不要低于1.5%）这么高呀！我用的是0.8%,45
